Molecular characterization of antibiotic resistant clinical isolates

Abstract

A prevalência de isolados bacterianos, da família Enterobacteriaceae, resistentes a cefalosporinas de largo espectro, produtores de β-lactamases de largo espectro (ESBLs) e/ou AmpCs tem vindo a aumentar. Tem sido também reportada a coocorrência de genes que codificam para ESBLs e genes que conferem resistência a outras classes de antibióticos. Esta situação tem como consequências a limitação de opções terapêuticas e o insucesso da terapia, traduzindo-se em taxas de mortalidade e morbilidade mais elevadas. Este trabalho focou-se na caracterização molecular de 46 isolados clínicos resistentes a antibióticos, pertencentes à família Enterobacteriaceae. Os isolados foram previamente obtidos no Hospital Infante D. Pedro, Centro Hospitalar do Baixo Vouga, E.P.E., e foram selecionados para análise com base na suspeita de produção de ESBLs e/ou AmpCs, de acordo com o sistema automático Vitek2®. Os isolados foram caraterizados em termos de diversidade genotípica, presença de genes de resistência e elementos genéticos móveis. Foram observados determinantes genéticos responsáveis pela resistência a β-lactâmicos (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M e blaCMY), fluoroquinolonas (qnrA, qnrB e aac(6’)-ib -cr), sulfonamidas (sul1 e sul2) e aminoglicosídeos (aac(6’)-ib ). O gene blaTEM foi o mais prevalente (97,8%), enquanto o gene blaSHV foi o menos prevalente (6,5%) entre os isolados. A variante blaCMY do gene blaAmpC foi a mais frequente em contexto adquirido (n=10 isolados). A variante blaCTX-M-15 foi observada na maioria (94,4%) dos isolados blaCTX-M + e surge associada à sequência de inserção ISEcp1. Foram identificados genes codificantes para o fenótipo de resistência a aminoglicosídeos (aadA1, aadA2, aadA5 e aadB), trimetoprim (dfrA1, dfrA12, dfrA15 e dfrA17), cloranfenicol (catB3) e estreptotricina (sat2) nas regiões variáveis dos integrões de classes 1 e 2, presentes em 34 e 1 isolados, respetivamente. Além dos integrões, foram encontrados outros elementos genéticos móveis como sequências de inserção, nomeadamente, ISEcp1 e plasmídeos conjugativos pertencentes aos grupos IncF, IncK, IncB/O e IncI1. Foram realizados ensaios de conjugação para 8 isolados blaCTX-M-15 + e 7 isolados blaCMY +, originando 2 e 3 transconjugantes, respetivamente. Com este trabalho foi possível concluir que a resistência às cefalosporinas de 3ª geração neste hospital está predominantemente associada a mecanismos de resistência adquirida. Os resultados referentes à tipagem molecular, recorrendo a BOX-, ERIC- e rep-PCR, sugerem que a disseminação de produtores de ESBLs e/ou AmpCs neste hospital será policlonal, dada a variabilidade intra-espécies observada. Não se identificaram clones prevalentes em diferentes serviços ou associados à comunidade. De facto, a disseminação dos determinantes de resistência parece estar relacionada com transferência de elementos genéticos móveis, nomeadamente dos replicões IncB/O, K, I1 e Frep. A presença de integrões nestes isolados resulta com frequência em fenótipos de multirresistência. Serão necessários mais estudos para caracterizar os elementos genéticos móveis com maior detalhe. O estudo aqui apresentado repre senta uma contribuição importante para a definição de estratégias de controlo da disseminação de bactérias resistentes a cefalosporinas de largo espectro no Hospital Infante D. Pedro.

The prevalence of Enterobacteriaceae isolates displaying resistance to broad-spectrum cephalosporins, harboring extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) and/or AmpC enzymes is increasing. Moreover, the co-occurrence of ESBLs and genes conferring resistance to other antibiotic classes is frequently reported. This situation leads to a limitation of therapeutic options and unsuccessful therapy and consequently to higher rates or mortality and morbidity. This work focused on the molecular characterization of 46 antibiotic resistant clinical isolates belonging to Enterobacteriaceae family. These isolates were previously obtained from Hospital Infante D. Pedro, Centro Hospitalar do Baixo Vouga, E.P.E., and were selected for analysis based on the suspicion of ESBL and/or AmpC production provided by the Vitek2® Automatic System. The isolates were characterized in terms of genetic diversity, resistance genes and mobile genetic elements. Genetic determinants conferring resistance to β-lactams (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M and blaCMY), fluoroquinolones (qnrA, qnrB and aac(6’)-ib -cr), sulfonamides (sul1 and sul2) and aminoglycosides (aac(6’)-ib) were observed. blaTEM was the most prevalent gene (97.8%) while blaSHV gene was the least prevalent (6.5%) among isolates. blaCMY variant of the blaAmpC genes was the most frequent in an acquired context (n=10 isolates). blaCTX-M-15 variant was found in the majority of the isolates that tested positive for the blaCTX-M gene (94.4%) and is frequently associated with the insertion sequence ISEcp1. Resistance genes coding resistance phenotype to aminoglycosides (aadA1, aadA2, aadA5 and aadB), trimetoprim (dfrA1, dfrA12, dfrA15 and dfrA17), chloramphenicol (catB3), and streptothricin (sat2) were also identified in the variable regions of class 1 and 2 integrons, found in 34 and 1 isolates, respectively. Aside from integrons, other mobile genetic elements like insertions sequences, ISEcp1 and conjugative plasmids belonging to groups IncF, IncK, IncB/O and IncI1, were also identified. Mating assays were performed for 8 blaCTX-M-15 + isolates and 7 blaCMY + isolates, originating 2 e 3 transconjugants, respectively. It was possible to conclude that resistance to 3rd generation cephalosporins in this hospital is predominantly associated with acquired mechanisms. Molecular typing results, obtained by BOX-, ERIC- and rep-PCR, suggest a non-clonal dissemination of the ESBL and/or AmpC-producing isolates, based on the high intra-species diversity observed. Clones prevalent in the hospital or prevalent in the community were not identified. In fact, the dissemination of the resistance determinants seems to be related to the transference of mobile genetic elements, namely IncB/O, K, I1 and Frep replicons. Also, the presence of integrons often results in a multidrug phenotype. Further studies need to be conducted to identify these elements with more detail. This study represents an important contribution to the development of effective strategies aiming to reduce the dissemination of broad - spectrum cephalosporins resistant bacteria in Hospital Infante D. Pedro.