A formulation based on cationic porphyrins in the photoinactivation of Pseudomonas syringae pv. actinidiae

Abstract

A Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) é uma bactéria fitopatogénica Gram negativa responsável por causar cancro bacteriano na planta do kiwi. Na última década, esta bactéria afetou fortemente a produção deste fruto a nível mundial, levando a perdas económicas significativas. Geralmente, o controlo da Psa baseia-se no uso de pulverização à base de cobre que apresenta elevada ecotoxicidade e persistência ambiental. A aplicação da terapia fotodinâmica antimicrobiana como uma alternativa promissora na inativação da Psa já foi demonstrada em estudos recentes tendo-se alcançado reduções do teor de Psa de 4 log, usando como fotossensibilizador o derivado porfirínico tetracatiónico Tetra-Py+-Me em 3 ciclos de tratamento com irradiância de 150 mW cm-2. Neste tipo de terapia é necessária a ação conjunta de um fotossensibilizador (PS), oxigénio molecular e luz visível que conduz à produção de espécies reativas de oxigénio (ROS), capazes de comprometer a integridade da célula microbiana. Dada a inespecificidade da ação fotodinâmica, as espécies reativas de oxigénio produzidas podem reagir com diferentes alvos celulares, tornando-se improvável o desenvolvimento de resistências por parte dos microrganismos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência fotodinâmica de uma formulação constituída por cinco porfirinas catiónicas na inativação da Psa. Esta formulação foi preparada de modo a ter como principal componente a porfirina tri-catiónica considerada um dos fotossensibilizadores mais eficientes na fotoinativaçao de diversos microrganismos. Os estudos in vitro realizados na concentração de 5.0 μM e uma irradiância de 4.0 mW cm-2, permitiram obter uma fotoinativação de 7,4 log ao fim de 60 min de irradiação. Dada a eficiência fotodinâmica observada foram realizados diversos ensaios com o fotossensibilizador numa concentração de 50 μM em folhas de kiwi (ex vivo), sob diferentes condições de irradiação e de contaminação: 1) luz artificial de baixa irradiância (4.0 mW cm-2) com inoculação artificial, 2) radiação solar (23 e 60 mW cm-2) com inoculação artificial e 3) radiação solar (23 mW cm-2) com folhas naturalmente contaminadas. Foram ainda avaliadas neste estudo a recuperação de viabilidade da Psa e o desenvolvimento de resistências após sucessivos tratamentos fotodinâmicos sub-letais. Os ensaios ex vivo com folhas artificialmente contaminadas com Psa permitiram observar uma fotoinativação de 2,8 e 4,5 log em condições de iluminação artificial e radiação solar, respetivamente, após 90 min de irradiação. Após um segundo tratamento com radiação solar a fotoinativação foi de 6,2 log. A fotoinativação da Psa nas folhas de kiwi naturalmente contaminadas foi de cerca de 2,3 log após 90 min de irradiação ao sol. Ao fim de 10 ciclos de tratamento em condições sub-letais de fotoinativação da Psa não se observou desenvolvimento de resistências (manteve-se o perfil de inativação fotodinâmico) nem ocorreu recuperação de viabilidade por parte da Psa. Os resultados deste estudo sugerem que a terapia fotodinâmica antimicrobiana poderá ser uma alternativa aos métodos atuais no controlo da Psa, uma vez que a sua inativação foi demonstrada inclusive sob radiação solar, sem se terem observado efeitos negativos sobre as folhas de kiwi.

Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) is a Gram negative phytopathogenic bacterium responsible for bacterial canker on kiwifruit plant. Over the last decade, this bacterium dramatically affected the production of this fruit worldwide, causing significant economic losses. Generally, Psa control consists in the application of copper based sprays which are toxic and persist in the environment. The application of antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) as an alternative to inactivate Psa has already been demonstrated in recent studies that showed a 4 log Psa reduction using the cationic porphyrin Tetra-Py+-Me as photosensitizer (PS) and 3 consecutive cycles of treatment with a light irradiance of 150 mW cm-2. In this type of therapy occurs the interaction of a photosensitizer (PS), molecular oxygen and visible light, that leads to the generation of reactive oxygen species (ROS), capable to comprise the integrity of microbial cells. Given the non-specificity of the photodynamic action, these reactive species can interact with different cell targets, making resistance development an improbable event. The present work aimed to evaluate the photodynamic efficiency of a formulation constituted with 5 cationic porphyrin derivatives, as photosensitizer, in Psa inactivation. This formulation was prepared to have as main component the tri-cationic porphyrin which is considered one of the most efficient photosensitizers in the photoinactivation of microorganisms. The in vitro study with a PS concentration of 5.0 μM and low radiance (4.0 mW cm-2), showed a 7.4 log photoinactivation after 60 min. Due to the observed efficiency in the in vitro tests, several assays were performed with the PS at 50 μM on kiwifruit leaves (ex vivo), under different conditions of light and inoculation: 1) low radiance (4.0 mW cm-2) with artificial inoculation; 2) sunlight (60 and 23mW cm-2) with artificial contamination; 3) sunlight (23 mW cm-2) with naturally contaminated leaves. aPDT viability recovery and resistance development assays were also assessed. In the ex vivo assays with artificially contaminated leaves were observed a 2.8 and 4.5 log inactivation with low radiance and sunlight, respectively, after 90 min irradiation. After a second treatment with sunlight a 6.2 log inactivation was achieved. The photoinactivation on naturally contaminated leaves was about 2.3 log after 90 min sunlight irradiation. Ten consecutive cycles of phototreatment in sub-lethal conditions, showed that Psa does not develop resistance, nor recover viability. The results of this study suggest that aPDT can be an alternative to the current methods used to control Psa, since it was possible to inactivate this bacterium under sunlight, without damaging the leaves.