Estudo de tRNAs virais codificados pelo genoma do vírus MHV-68

Abstract

Uma partícula viral é um elemento genético não celular que depende de uma célula para se replicar, uma vez que é metabolicamente inerte e não desempenha funções de biossíntese nem respiratórias. No seu estado extracelular é uma partícula submicroscópica composta por uma molécula de ácido nucleico, RNA ou DNA, envolvida por proteínas e, em certos casos, por outras macromoléculas. O genoma viral é pequeno e, de um modo geral, codifica apenas componentes metabólicos e estruturais que não podem ser adaptados do hospedeiro, o que torna a sua replicação, transcrição e tradução altamente dependente da maquinaria celular: o vírus redirecciona funções metabólicas e a maquinaria celular preexistente para se multiplicar e dar origem a novas partículas infecciosas - viriões. O genoma de muitos vírus de DNA, como é o caso do herpes vírus, é dirigido para o núcleo da célula infectada, onde interage com a maquinaria do hospedeiro, capaz de transcrever o DNA viral em mRNA que, por sua vez, é traduzido em proteínas virais pelos tRNAs, ribossomas e factores de tradução celulares. Surpreendentemente, o genoma do gama–herpes vírus-68 murino (MHV-68), contrariamente a outros vírus, codifica oito sequências do tipo tRNA –vtRNAs– expressos em níveis elevados durante as fases de infecção lítica e de latência. Estas moléculas são processadas em tRNAs maduros, com adição póstranscripcional do terminal 3’CCA mas, no entanto, não são aminoaciladas pelas aminoacil-tRNA-sintetases da célula infectada, indicando que não devem participar nas vias de síntese proteica. Até à data, a função biológica desempenhada pelo vtRNAs permanece desconhecida. O principal objectivo do presente trabalho foi contribuir para elucidar a função biológica e caracterização molecular dos vtRNAs codificados pelo genoma do vírus MHV -68. Numa primeira fase, recorrendo a estudos de bioinformática, o alinhamento das sequências nucleotídicas dos vtRNAs revelou a presença de um motivo semi-conservado na região do loop D dos oito vtRNAs. Uma pesquisa de sequências homólogas a este motivo, numa base de dados, detectou que a mesma sequência nucleotídica também está presente e conservada na região do loop D de tRNAs mitocondrialmente importados de protozoários. Além disso, verificou-se que, em Leishmania, esta sequência conservada – UGGYAGAGC – é necessária e suficiente à importação dos tRNAs para a mitocôndria. Assim, numa segunda fase do trabalho, foi proposto e investigado se o motivo semi-conservados no loop D dos tRNAs virais actua como um sinal capaz de dirigir in vivo, os vtRNAs para as mitocôndrias de células infectadas por MHV -68. Os resultados indicam que não existe um mecanismo de importação para a matriz mitocondrial dos vtRNAs. Por último, com o intuito de criar um novo modelo, facilmente manuseável, para o estudo das características e funções dos vtRNAs, Saccharomyces cerevisiae foi transformada com o vector pRS426, contendo as sequências codificantes para os vtRNAs1, 2, 3, 4 e 5. Os resultados revelam que os vtRNAs podem ser expressos em levedura e indicam que estas moléculas têm um comportamento semelhante ao que apresentam quando são expressas em células infectadas pelo vírus MHV -68.

A virus particle is a noncellular genetic element that relies on the host cell for its own replication since it is metabolically inert and does not carry out respiratory or biosynthetic functions. In the extracellular state it is a submicroscopic particle containing nucleic acid, DNA or RNA, surrounded by proteins and occasionally containing other macromolecular components. Viral genomes are very limited in size and they encode primarily those functions that they cannot adapt from their hosts. Therefore, during reproduction inside a susceptible cell, there is a heavy dependence on host-cell structural and metabolic components. The virus redirects pre-existing host machinery and metabolic functions necessary for virus replication. The DNA genome of most DNA-containing viruses, such as herpes viruses, ends up in the cell nucleus where it interacts with the host machinery for transcribing mRNA, which is translated into viral proteins by the host cell ribosomes, tRNAs and translation factors. Surprisingly the Murine gammaherpesvirus-68 (MHV-68) genome encodes eight novel tRNA-like sequences– vtRNAs - expressed to high levels during both latent and litic infection and constituted the first report of tRNA-like sequences encoded by a virus of eucaryotes. These vtRNAs are processed into mature tRNAs with post-transcriptionally added 3’CCA termini but they are not aminoacylated by aminoacil-tRNA synthetases present in the infected cell. Therefore the biological function that these vtRNAs may fulfil is currently unclear. The aim of the present work was to contribute for the biological and molecular characterization of novel vtRNAs encoded by MHV -68. In the first stage of this study, using bioinformatic tools, the alignment of the nucleotide sequences of the vtRNAs revealed a shared semi-conserved motif, present in the D arm, and homology searches of this sequence against a database showed that this motif is also present and conserved in the D arm of protozoa tRNAs mitochondrialy imported. Besides that, in Leishmania, this conserved sequence is necessary and sufficient for import of tRNAs into mitochondria. Therefore it was proposed and investigated that the short semi-conserved motif in the D arm of vtRNAs acts as a targeting sinal and directs in vivo the import of vtRNAs into mitochondria of MHV-68 infected cells. According to the results it doesn’t appear to exist an import mechanism of MHV-68 vtRNAs into mitochondria. Finally, in order to create a new easy to handle model, for the study of the function and features of vtRNAs, Saccharomyces cerevisiae was transformed with a pRS426 vector containing the vtRNAs 1, 2, 3, 4 and 5. The results proved that vtRNAs are expressed in yeast and it seems that these molecules have the same behaviour as when they are expressed during an in vivo infection.