Antibiotic and metal(loid) resistance of Pedobacter lusitanus NL19 and its closely-related species

Abstract

Pedobacter lusitanus NL19 was isolated from a sludge collected from a deactivated uranium mine, Quinta do Bispo (Viseu, Portugal). The sampling site is characterized by high levels of metals and radionuclides. In silico genome analysis of NL19 disclosed several antibiotic resistancerelated genes (β-lactamase, efflux pumps, etc.) and also genetic determinants related with the resistance/tolerance to metal(loid)s (arsenic, zinc, cobalt and cadmium). The main objective of this study was to investigate the antibiotic resistance and metal(loid)s tolerance of P. lusitanus NL19, the closely-related species P. himalayensis MTCC 6384T, P. hartonius DSM 19033T, P. cryoconitis DSM 14825T and P. westerhofensis DSM 19036T as well as the genus type strain, P. heparinus DSM 2366T. The results of disk-diffusion susceptibility testing and MIC determination showed that all the strains are resistant to amoxicillin/clavulanic acid, ampicillin, apramycin sulfate, aztreonam, cefepime, cefoxitin, ceftazidime, cefuroxime, penicillin G, piperacillin, piperacillin/tazobactam, amikacin, gentamicin, netilmicin, streptomycin, tobramycin, ciprofloxacin and colistin. Regarding the carbapenems all the strains are resistant to ertapenem and the majority were sensitive to meropenem and imipenem. The exceptions included resistance to meropenem by P. westerhofensis and decreased susceptibility to imipenem by P. himalayensis. The tolerance to metal(loid)s was tested through the determination of the MIC. P. lusitanus exhibited higher MICs than all the other strains, for copper and cadmium. P. lusitanus, P. himalayensis and P. hartonius were the most tolerant to zinc and nickel. Two genes encoding putative β-lactamases were identified in the genome of P. lusitanus NL19. The proteins encoded by these genes are novel members of class A β-lactamases (LUS-1) and subclass B3 metallo-β- lactamases (PLN-1), considering their low scores with other β-lactamases. To futher understand if these two enzymes had the ability to hydrolyse β- lactams, the genes blaLUS-1 and blaPLN-1 were expressed in E. coli (fused to an E. coli signal peptide) and MIC to β-lactams were determined. Results indicate that PLN-1 is able to degrade carbapenems and 1st, 3rd and 4th generation cephalosporins and cephamycines. However, no significant activity was detected for LUS-1. Our study shows that the multiresistance phenotype identified in P. lusitanus NL19 is also observed in its closely-related species. In addition, it seems clear that the Pedobacter genus have an underexplored pool of antibiotic resistance genes as well as putative novel antibiotic resistance mechanisms. The tolerance to metal(loid)s was more strain-specific and, therefore, it appears to be related to the ecological niches that these strains occupy.

Pedobacter lusitanus NL19 foi isolada de lamas recolhidas numa mina de urânio desativada, na Quinta do Bispo (Viseu, Portugal). O local da recolha das amostras é caracterizado pela presença de elevadas concentrações de metais e radionuclídeos. A análise do genoma da estirpe NL19 revelou a presença de vários genes de resistência a antibióticos (β-lactamases, bombas de efluxo, e outros) e também de determinantes genéticos de resistência a metais e metalóides (arsénio, zinco, cobalto e cádmio). O principal objetivo deste estudo foi investigar a resistência a antibióticos e a tolerância a metais e metalóides por P. lusitanus NL19, por outras quatro espécies próximas, P. himalayensis MTCC 6384T, P. hartonius DSM 19033T, P. cryoconitis DSM 14825T e P. westerhofensis DSM 19036T, e ainda pela estirpe tipo deste género, P. heparinus DSM 2366T. Os resultados de teste de difusão em disco e a determinação da MIC monstraram que todas as estirpes são resistentes à amoxicilina/ácido clavulânico, ampicilina, apramicina, aztreoname, cefepima, cefoxitina, ceftazidima, cefuroxima, penicilina G, piperacilina, piperacilina/tazobactama, amicacina, gentamicina, netilmicina, streptomicina, tobramicina, ciprofloxacina e colistina. No que se refere aos carbapenemos, todas as estirpes são resistentes ao ertapenemo e a maioria é sensível ao meropenemo e ao imipenemo. As excepções incluem a resistência ao meropenemo de P. westerhofensis e diminuição da susceptibilidade ao imipenemo de P. himalayensis. No que se refere à tolerância aos metais, valores de MIC mais elevados foram registados para P. lusitanus para o cobre e o cádmio. P. lusitanus, P. himalayensis e P. hartonius são as estirpes mais tolerantes ao zinco e níquel. A análise do genome de P. lusitanus NL19 permitiu a identificação de dois genes que codificam para β-lactamases putativas. Estas proteínas foram consideradas como novos membros das β-lactamases de classe A (LUS- 1) e da subclasse B3 metalo-β-lactamases (PLN-1) devido aos seus baixos scores com outras β-lactamases. Para compreender se estas enzimas têm a capacidade de hidrolisar β-lactâmicos, os genes blaLUS-1 e blaPLN-1 foram expressos em E. coli (fundidos com um péptido sinal de E. coli). A determinação dos valores da MIC para β-lactâmicos indicam que PLN-1 é capaz de hidrolisar carbapenemos e cefalosporinas de 1ª, 3ª e 4ª geração e cefamicinas. Contudo, não foi detectada nenhuma atividade significativa para a LUS-1. Este estudo mostra que o fenótipo de multi-resistência identificado em P. lusitanus NL19 também é comum a outras espécies estreitamente relacionadas do mesmo género. Para além disso, é possível perceber que as espécies do género Pedobacter possuem um pool inexplorado de genes de resistência a antibióticos bem como de putativos novos mecanismos de resistência a antibióticos. A tolerância a metais e metalóides é específica para cada estirpe, podendo estar associda ao nicho ecológico que estas estirpes ocupam.