Caracterização de uma proteinase aspártica de Cynara cardunculus L. por electroforese em gel e espectrometria de massa

Abstract

Uma nova proteinase aspártica foi extraída do cardo Cynara cardunculus L., à semelhança das cardosinas A e B, através de extracção acídica, seguida de purificação em três passos. A purificação envolveu cromatografia de exclusão molecular e cromatografia de troca iónica usando uma coluna Q-Sepharose. Como a cardosina A0 não se encontrava pura efectuou-se uma nova cromatografia de troca iónica usando uma coluna de Mono Q. Após esta cromatografia obtiveram-se 4 fracções denominadas de 1P, 2P, 3P e 4P. Para cada uma destas fracções determinou-se a actividade proteolítica e a especificidade. Fizeram-se estudos de mobilidade aparente quer por SDSPAGE, quer por electroforese em condições nativas. Para as fracções 3P e 4P foi determinado o ponto isoeléctrico da proteína em condições nativas e das subunidades separadamente. Foi determinada a glicosilação dessas duas fracções. Foram, ainda, feitos estudos das fracções 3P e 4P por espectrometria de massa, utilizando electrospray. Os resultados de SDS - PAGE demonstraram não existirem diferenças de massa aparente entre a cardosina A e as fracções 1P, 2P, 3P e 4P da cardosina A0. A electroforese em condições nativas revelou diferenças ao nível de mobilidade de cada uma das fracções e entre estas e a cardosina A, o que demonstra a existência de diferenças de carga entre todas as fracções. Estudos de hidrólise da caseína total e da cadeia ß da insulina oxidada revelaram diferenças de actividade entre a cardosina A e as fracções 1P, 2P, 3P e 4P da cardosina A0. Os resultados da hidrólise da cadeia ß da insulina oxidada indicam que todas as fracções da cardosina A0 apresentam a mesma especificidade que a cardosina A e apontam no sentido de todas elas eventualmente possuírem diferenças ao nível da selectividade. A determinação do ponto isoeléctrico das fracções 3P e 4P, na forma nativa e das subunidades separadamente, permitiu verificar diferenças ao nível do ponto isoeléctrico entre elas. A revelação de géis de SDS -PAGE usando o regente de Schiff (método de PAS) permitiu constatar que as fracções 3P e 4P são glicosiladas nas duas subunidades à semelhança da cardosina A. Os estudos de espectrometria de massa dos digestos trípticos das proteinases, com e sem açúcares ligados, revelam diferenças entre a cardosina A e as fracções 3P e 4P. Todos os estudos das fracções 3P e 4P apontam para o facto de estarmos perante formas enzimáticas distintas da cardosina A possuindo pequenas diferenças ao nível da sequência peptídica e/ou da fracção glicosídica.

A new aspartic proteinase was extracted from the cardoon Cynara cardunculus L. as well as the known cardosins A and B, with acid extraction and further purification in three steps. This purification involves size exclusion and anion exchange chromatographies using Q-sepharose column. Cardosin A0 was not pure and it was resolved a new anion exchange chromatography with a Mono Q column. After this step four fractions denominated 1P, 2P, 3P and 4P were purified. For each fraction proteolytic activity and specificity was determined. Relative mobility for each fraction by SDS-PAGE and electrophoresis under native conditions was carried out. For 3P and 4P fractions isoeléctric point of native protein and subunities separately were determined. Glycosilated was determinate of fractions 3P and 4P. Studies by mass spectrometry using electrospray ionisation of fractions 3P and 4P were performed. Results of SDSPAGE demonstrate that do not exist apparently differences in migration of cardosin A and 1P, 2P, 3P and 4P fractions. Electrophoreses in native conditions revelled protein migration differences between fractions 1P, 2P, 3P and 4P of cardosin A0 and between this fractions and cardosin A. There results demonstrate differences of charge between all fractions. Hydrolytic studies of total casein and ß-chain of oxidised insulin revelled differences of activity between cardosin A and fractions 1P, 2P, 3P and 4P of cardosin A0. Results of hydrolysis of ß-chain of oxidised insulin indicate that all fractions of cardosin A0 have the same specificity as cardosin A and suggest eventually differences in selectivity between all fractions and cardosin A. Isoeletric point determination of fractions 3P and 4P of the native proteins and of each subunit reveal differences between them. Revelation of SDS -PAGE gels by Schiff reagent (PAS method) allowed to verify that fractions 3P and 4P are glycosilated in both subunits as cardosin A. Mass spectrometry studies of tryptic digests of fractions 3P and 4P of cardosin A0 with and without sugars linked reveal differences between cardosin A and fractions 3P and 4P of cardosin A0. All studies of fractions 3P and 4P indicate the fact that we are in the presence of enzymatic forms different from cardosin A, with small differences in peptide sequence and/or glycosydic fraction.