Role of the sphingomyelinase Isc1p in the regulation of iron homeostasis in Saccharomyces cerevisia

Abstract

Iron is an essential element for cell viability since it is a component of several metalloproteins, containing iron-sulfur clusters and heme centers. The ability to gain and lose electrons, switching between the ferrous (Fe2+) and ferric (Fe3+) states, renders the involvement of iron in many cellular processes. Iron acquisition systems have to be highly regulated to assure a continuous supply of iron but simultaneously prevent its toxicity associated with the formation of hydroxyl radicals by the Fenton reaction. Loss of iron homeostasis is behind many pathologies, highlighting the importance of understanding the mechanisms involved in iron homeostasis. The Saccharomyces cerevisiae inositolphosphosphingolipid phospholipase C (Isc1p) hydrolyses complex sphingolipids to produce ceramide, a bioactive sphingolipid. ISC1 deletion is characterized by premature aging, oxidative stress sensitivity and mitochondrial dysfunction. This mutant also exhibits an up regulation of genes involved in iron uptake leading to increased levels of iron. However the growth phase in which iron accumulation occurs, the specific site of accumulation or even the oxidation state of the accumulated iron in isc1Δ cells remains uncharacterized. Futhermore, the molecular mechanisms behind the iron overload in isc1Δ cells are not known. By monitoring iron levels and oxidation state along growth, it was possible to observe that deletion of ISC1 caused iron accumulation in all phases of growth in both the ferric and ferrous forms. Additionally to the increased iron levels, isc1Δ cells also exhibited an altered distribution of iron within the cell. Unlike wild type, isc1Δ cells did not accumulate ferric iron in the vacuole, but instead, iron seemed to be distributed throughout the cell. Furthermore, iron accumulation in isc1Δ cells was associated with the activation of Aft1p, the low iron-sensing transcriptional activator. Cells lacking Isc1p exhibed higher levels of Aft1p retained in the nucleus, and AFT1 deletion abolished iron accumulation in the isc1Δ mutant. It was also found that dephosphorylation of Aft1p in isc1Δ cells is associated with its activation. Additionally the activation of the phosphatase Sit4p in isc1Δ cells was discarded as a potential mechanism behind Aft1p dephosphorylation and activation, since isc1Δsit4Δ cells still exhibit iron overload. Overall, these results indicate that the dephosphorylation and activation of Aft1p is the factor behind the accumulation of iron in the isc1Δ mutant and reinforce the role of Isc1p in the regulation of iron homeostasis.

O Ferro é um elemento essencial para a viabilidade celular, sendo um componente de diversas metaloproteínas, contendo grupos de ferro e enxofre e centros heme. A capacidade de ganhar e perder eletrões, alterando entre os estados ferroso (Fe2+) e férrico (Fe3+), faz com que o ferro esteja envolvido em diversos processos celulares. Os sistemas de aquisição de ferro têm de ser altamente regulados para assegurar um fornecimento contínuo de ferro e simultaneamente prevenir a sua toxicidade associada à formação de radicais hidroxilo pela reação de Fenton. A perda da homeostasia do ferro está associada a muitas patologias, o que enfatiza a importância do estudo dos mecanismos envolvidos na homeostasia do ferro. A proteína inositolfosfoesfingolípido fosfolipase C (Isc1p) presente em Saccharomyces cerevisiae hidrolisa esfingolípidos complexos para produzir ceramida, um esfingolípido bioativo. A deleção do ISC1 é caracterizada pelo envelhecimento celular prematuro, sensibilidade ao stresse oxidativo e disfunção mitocondrial. Este mutante também exibe uma sobreexpressão dos genes envolvidos na captação de ferro, resultando em níveis elevados de ferro. No entanto, a fase do crescimento em que a acumulação do ferro ocorre, o compartimento específico de acumulação ou mesmo o estado de oxidação do ferro acumulado nas células isc1Δ permanece por caracterizar. Além disso, os mecanismos moleculares subjacentes à acumulação de ferro nas células isc1Δ não são conhecidos. Monitorizando os níveis de ferro e o estado de oxidação ao longo do crescimento, foi possível observar que a deleção do ISC1 causou uma acumulação de ferro em todas as fases de crescimento em ambas as formas ferrosa e férrica. Além dos níveis de ferro elevados, as células isc1Δ também exibiram uma alteração na distribuição de ferro no interior da célula. Ao contrário das células wt, as células isc1Δ não acumularam ferro férrico no vacúolo, mas em vez disso, o ferro pareceu estar distribuído por toda a célula. Adicionalmente, a acumulação de ferro nas células isc1Δ foi associada à ativação do Aft1p, o ativador transcricional sensível a níveis baixos de ferro. Células sem a proteína Isc1p exibiram níveis mais elevados de Aft1p retido no núcleo e a delecção do AFT1 suprimiu a acumulação de ferro observada no mutante isc1Δ. Também se observou que a defosforilação do Aft1p nas células isc1Δ está associada à sua ativação. Adicionalmente, a ativação da fosfatase Sit4p nas células isc1Δ como um potencial mecanismo responsável pela defosforilação e ativação do Aft1p foi descartada, uma vez que as células isc1Δsit4Δ continuam a apresentar acumulação de ferro. Em conclusão, estes resultados indicam que a defosforilação e ativação do Aft1p é o fator responsável pela acumulação de ferro no mutante isc1Δ e reforça o papel do Isc1p na regulação da homeostasia do ferro.