Directed evolution of lichenicidin

Abstract

Lichenicidin is a class II lanthipeptide composed by two peptides, Bliα and Bliβ, that is produced by several strains of Bacillus licheniformis. These peptides act synergistically in order to inhibit the growth of other Gram positive bacteria. Due to their antibacterial activity, they are also designated lantibiotics. Unlike other antimicrobial peptides produced by bacteria, lantibiotics are ribosomally synthesized as an immature peptide and suffer several post-translational modifications to achieve their active form. Thus, it is easier the application of bioengineering strategies aiming the creation of new variants with different bioactivity. The aims of this study were: i) the development a heterologous expression system for the production of lichenicidin allowing a white/blue selection and using E. coli, ii) the generation of two random mutagenesis libraries for each one of the lichenicidin peptides and iii) the selection and analysis of clones with reduced bioactivity when compared with the control. To develop the heterologous system, preliminary tests were conducted that allowed the selection of E. coli Mach1 as the recipient strain. In addition, 37 ºC was established as the best temperature for lichenicidin production. Thus, two random mutagenesis libraries of the structural genes licA1 and licA2, encoding the precursor peptides of Bliα and Bliβ, respectively. Subsequently, the bioactivity of around 4000 clones of each library was analyzed by colony-agar bioassay. In the present study, colonies with improved activity were not possible to detect in any of the libraries. Regarding the Bliα library, about 4,5 % of the clones showed null bioactivity, while 2,6 % and 2,2 % of the clones showed very reduced and activity reduced to half when compared with the control, respectively. In the Bliβ library, the values were very similar since about 5,1 % of the clones showed no bioactivity, 1,4 % showed very reduced activity and 3,8 % had activity reduced to half when compared with the control. Some of these clones were selected for sequencing reaction in order to identify the mutations causing the observed phenotypes. This analysis confirmed the importance of the conserved residues for the bioactivity of both peptides. Moreover, it was found that substitutions involving charged amino acids and prolines result in the production of inactive peptides.

A lichenicidina é um lantipéptido da classe II constituído por dois péptidos, Bliα e Bliβ, produzido por diversas estirpes de Bacillus licheniformis. Estes péptidos atuam sinergisticamente, de forma a inibirem o crescimento de outras bactérias de Gram positivo, sendo por isso também designados de lantibióticos. Ao contrário de outros compostos antimicrobianos produzidos por bactérias, os lantibióticos são produzidos na sua forma imatura diretamente pelo ribossoma e sofrem diversas alterações pós-traducionais, que os tornam péptidos ativos. Desta forma, torna-se mais fácil a aplicação de técnicas de bioengenharia de modo a obter novas variantes com bioatividade alterada. Os objetivos deste trabalho foram i) a construção de um sistema de expressão heteróloga da lichenicidina em E. coli que permitisse a seleção azul/branco, ii) a construção de uma biblioteca por mutagénese aleatória para cada um dos péptidos que constituem a lichenicidina e iii) a seleção e análise de clones com bioatividade reduzida relativamente ao controlo. Para a criação do sistema de expressão heteróloga, foram realizados vários ensaios preliminares, que levaram à seleção da estirpe E. coli Mach1 como recetora assim como à seleção da temperatura de produção de 37 ºC. Assim sendo, foram construídas duas bibliotecas por mutagénese aleatória dos genes estruturais licA1 e licA2, que codificam os péptidos percursores de Bliα e Bliβ, respetivamente. Subsequentemente, a bioatividade de cerca de 4000 clones de cada biblioteca foi analisada através de bioensaio em agar. Através desta análise, não foi possível detetar nenhum clone com bioatividade aumentada em ambas as bibliotecas. Relativamente à biblioteca do péptido Bliα, cerca de 4,5 % dos clones apresentaram bioatividade nula, enquanto que 2,6 % e 2,2 % dos clones apresentaram atividade muito reduzida e atividade reduzida a metade quando comparada com o controlo, respetivamente. Na biblioteca do péptido Bliβ, os valores foram bastante semelhantes, com cerca de 5,1 % dos clones a exibir atividade nula, 1,4 % com atividade muito reduzida e 3,8 % com atividade reduzida a metade quando comparada com o controlo. A sequência dos genes estruturais de alguns destes clones foram analisados, com o objetivo de identificar as alterações responsáveis por estes fenótipos. Esta análise confirmou a importância dos resíduos conservados para a bioatividade dos dois péptidos. Foi também possível reconhecer que substituições envolvendo aminoácidos carregados e prolinas resultam na produção de péptidos inativos.