Photodynamic inactivation of bacteria by cationic porphyrins : their cellular targets and potential environmental applications

Abstract

Photodynamic inactivation (PDI) is defined as the process of cell destruction by oxidative stress resulting from the interaction between light and a photosensitizer (PS), in the presence of molecular oxygen. PDI of bacteria has been extensively studied in recent years, proving to be a promising alternative to conventional antimicrobial agents for the treatment of superficial and localized infections. Moreover, the applicability of PDI goes far beyond the clinical field, as its potential use in water disinfection, using PS immobilized on solid supports, is currently under study. The aim of the first part of this work was to study the oxidative modifications in phospholipids, nucleic acids and proteins of Escherichia coli and Staphylococcus warneri, subjected to photodynamic treatment with cationic porphyrins. The aims of the second part of the work were to study the efficiency of PDI in aquaculture water and the influence of different physicalchemical parameters in this process, using the Gram-negative bioluminescent bacterium Vibrio fischeri, and to evaluate the possibility of recycling cationic PS immobilized on magnetic nanoparticles. To study the oxidative changes in membrane phospholipids, a lipidomic approach has been used, combining chromatographic techniques and mass spectrometry. The FOX2 assay was used to determine the concentration of lipid hydroperoxides generated after treatment. The oxidative modifications in the proteins were analyzed by one-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Changes in the intracellular nucleic acids were analyzed by agarose gel electrophoresis and the concentration of doublestranded DNA was determined by fluorimetry. The oxidative changes of bacterial PDI at the molecular level were analyzed by infrared spectroscopy. In laboratory tests, bacteria (108 CFU mL-1) were irradiated with white light (4.0 mW cm-2) after incubation with the PS (Tri-Py+-Me-PF or Tetra-Py+-Me) at concentrations of 0.5 and 5.0 μM for S. warneri and E. coli, respectively. Bacteria were irradiated with different light doses (up to 9.6 J cm-2 for S. warneri and up to 64.8 J cm-2 for E. coli) and the changes were evaluated throughout the irradiation time. In the study of phospholipids, only the porphyrin Tri-Py+-Me-PF and a light dose of 64.8 J cm-2 were tested. The efficiency of PDI in aquaculture has been evaluated in two different conditions: in buffer solution, varying temperature, pH, salinity and oxygen concentration, and in aquaculture water samples, to reproduce the conditions of PDI in situ. The kinetics of the process was determined in realtime during the experiments by measuring the bioluminescence of V. fischeri (107 CFU mL-1, corresponding to a level of bioluminescence of 105 relative light units). A concentration of 5.0 μM of Tri-Py+-Me-PF was used in the experiments with buffer solution, and 10 to 50 μM in the experiments with aquaculture water. Artificial white light (4.0 mW cm-2) and solar irradiation (40 mW cm-2) were used as light sources.

Os resultados deste trabalho mostraram que E. coli foi totalmente inativada com ambas as porfirinas, enquanto S. warneri foi completamente inativado apenas com a Tri-Py+-Me-PF, ao fim do tempo de irradiação previamente estabelecido. A IF induziu alterações no perfil fosfolipídico bacteriano, com aumento da abundância relativa de algumas das classes maioritárias de fosfolípidos, decréscimo de ácidos gordos insaturados, formação de espécies moleculares oxidadas a partir de ácidos gordos insaturados, nomeadamente nas cardiolipinas de S. warneri e nas fosfatidiletanolaminas de E. coli. Estas espécies oxidadas foram identificadas como derivados hidroxi e hidroperoxi (observados em E. coli) e também grupos carbonilo (em S. warneri). A formação de hidroperóxidos lipídicos confirmou os danos oxidativos nos fosfolípidos. A IF causou redução do conteúdo intracelular dos ácidos nucleicos bacterianos. Em E. coli observou-se a seguinte hierarquia de modificações: rRNA 23S > rRNA 16S > DNA genómico. Os ácidos nucleicos de S. warneri foram extensivamente reduzidos com a Tri-Py+-Me-PF após 5 min de irradiação, mas menos reduzidos com a Tetra-Py+-Me, após 40 min de irradiação. Esta degradação dos ácidos nucleicos ocorreu paralelamente à inativação e quando as células já estavam inativadas mais do que 99.9%. A IF induziu uma diminuição geral do conteúdo proteico de ambas as bactérias, sugerindo degradação em larga escala, ocorrendo as alterações de forma mais rápida e evidente com a porfirina Tri-Py+-Me-PF. Observou-se o aumento da expressão de algumas proteínas, alterações no peso molecular, desaparecimento após tratamento e formação de novas proteínas. As alterações foram associadas a mecanismos de resposta ao stress oxidativo. A espetroscopia de infravermelho mostrou ser um método rápido e económico de avaliar as alterações induzidas pela IF ao nível molecular. Evidenciou os resultados obtidos pelos métodos convencionais com maior detalhe, nomeadamente ao nível das ligações, grupos funcionais e conformações moleculares. As variações de pH (6.5 - 8.5), temperatura (10 - 25 ºC), salinidade (20 - 40 g L-1) e concentração de oxigénio não afetaram significativamente a IF de V. fischeri, uma vez que em todas as condições testadas o sinal bioluminescente diminuiu até ao limite de deteção do método (redução ≈ 7 log10). Os ensaios com água de aquacultura mostraram que a eficiência do processo é afetada pela presença de matéria em suspensão. A IF total de V. fischeri em água de aquacultura foi conseguida com luz solar na presença de 20 μM de Tri-Py+-Me-PF. Os híbridos nanomagnete-porfirina puderam ser reutilizados em 6 ciclos de IF e reciclados em 3 ciclos. Na reciclagem, houve perda de atividade de ciclo para ciclo, atribuída à perda de nanopartículas durante a recuperação. A acumulação de matéria orgânica causou uma redução da eficiência do processo durante a reutilização, contudo foi observada a eliminação de 38 a 42 log10 de bactérias ao fim de 21h30 a 27h de tratamento. O FS não foi fotodegradado e a magnetite das nanopartículas não foi afetada pela irradiação ou pela oxidação inerente ao processo fotodinâmico. O presente trabalho demonstrou o caráter multi-alvo da inativação fotodinâmica, pela elucidação dos mecanismos oxidativos que ocorrem ao nível dos principais constituintes moleculares das bactérias. Também demonstrou que a inativação fotodinâmica é uma metodologia com potencial para ser implementada na desinfeção de águas de aquacultura utilizando fotossensibilizadores imobilizados, permitindo a sua reutilização e reciclagem, com a possibilidade de reduzir os custos associados a este tipo de tratamento.