Search for new lantibiotics

Abstract

A procura de microrganismos produtores de novos compostos antimicrobianos é primordial no combate ao fenómeno mundial de resistência microbiana face aos antimicrobianos atualmente disponíveis. A natureza é uma fonte de diversos produtos, entre os quais se podem destacar os antimicrobianos. Os péptidos naturais podem ser sintetizados in vivo, por bactérias, através de vias metabólicas ribossomais ou não ribossomais. De destaque entre os péptidos antimicrobianos ribossomais produzidos por bactérias são as bacteriocinas. As bacteriocinas de classe I incluem os péptidos com modificações pós-traducionais, os lantipéptidos, que são caracterizados pela presença dos aminoácidos lantionina e metil-lantionina. Os lantipéptidos com atividade antimicrobiana designam-se lantibióticos. Estes, são capazes de inibir o crescimento de várias bactérias de Gram-positivo clinicamente relevantes como, por exemplo, Staphylococcus aureus resistente à meticilina. O trabalho desenvolvido teve como objectivo a procura/ pesquisa de novos antibacterianos, produzidos por bactérias isoladas em ambientes pouco comuns, nomeadamente, grutas e locais muito contaminados por metais pesados - minas de urânio e de ferro. Para tal, testou-se a atividade antibacteriana de 76 bactérias isoladas nos diferentes locais contra 12 estirpes indicadoras, de Gram-positivo e de Gram-negativo. Todos os isolados que apresentaram atividade foram classificados por sequenciação do gene 16S rRNA. Dentro deste grupo, foram selecionadas bactérias pertencentes aos filos Firmicutes e Actinobacteria para a realização de ensaios de produção de antimicrobianos em cultura líquida. De seguida, determinou-se a estabilidade proteolítica e térmica dos antimicrobianos produzidos por três estirpes de B. amyloliquefaciens (SL8, Sma1 e MO15). Atualmente, existem e estão depositados nas bases de dados 13 genomas de B. amyloliquefaciens totalmente sequenciados. Assim, e utilizando a plataforma antiSMASH 2.0 procedeu-se à identificação de possíveis clusters de lantibióticos nesses genomas. Os genes biossintéticos de lantibióticos foram identificados apenas em três desses genomas; em dois desses genomas detectou-se o cluster de genes do lantibiótico mersacidina e no outro detectou-se a presença de um cluster ainda não caracterizado. Com base nessa informação, investigou-se a presença de genes característicos de operões biossintéticos de lantipéptidos nas estirpes SL8, Sma1 e MO15. O gene estrutural da mersacidina foi detectado nos três isolados. No entanto, o gene mrsM, que codifica para a enzima de modificação da mersacidina, apenas foi identificado nas estirpes SL8 e Sma1. Por outro lado, a amplificação de outra lanM não foi possível no isolado MO15. Foi ainda pesquisada a presença do péptido mersacidina, nos sobrenadantes das culturas líquidas destas estirpes, por MALDI-TOF/MS. Contudo, este lantibiótico não foi detectado em nenhum dos sobrenadantes. O presente estudo abre perspectivas para a identificação de lantibióticos nas estirpes em estudo. Por outro lado, outros estudos serão realizados envolvendo a pesquisa e caracterização dos compostos produzidos pelas restantes estirpes da coleção e que não foram exploradas nesta tese.

Searching for new antimicrobials is crucial to address the phenomenon of microbial resistance to the most common antibiotics. Nature is a source of several products, namely antimicrobials. Natural peptides can be synthetized in vivo by bacteria through a nonribosomal or a ribosomal pathway. Among the ribosomal antimicrobial peptides produced by bacteria, the so-called bacteriocins are worth attention. Among these, the class I bacteriocins comprise the post-translationally modified peptides, designated lanthipeptides, which are characterized by the uncommon amino acids lanthionine and methyllanthionine. The lanthipeptides with antimicrobial activity are referred as lantibiotics. The lantibiotics are able to inhibit the growth of several clinically relevant Gram-positive bacteria, such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus. This work aimed to search for new antibacterials produced by microorganisms isolated from uncommon sources, namely, caverns and heavy metal contaminated sites – uranium and iron mines. To that end, the antibacterial potential of 76 bacterial isolates from the different origins was investigated against 12 indicator strains, both Gram positive and Gram negative. All the isolates with antibacterial activity were affiliated by 16S rRNA gene sequence. Among these, bacteria belonging to the phyla Firmicutes and Actinobacteria were selected and included three Bacillus amyloliquefaciens - SL8, Sma1 and MO15. These isolates were investigated for antibacterial production assays in liquid culture. Supernatants with bioactivity were further investigated for proteolytic and temperature stability of the antimicrobial compounds produced. Presently, 13 genomes B. amyloliquefaciens are fully sequenced and assembled. Using the antiSMASH 2.0 platform putative clusters for lanthipeptides were surveyed in all of these genomes and were found on three of the genomes only. Two of these clusters corresponded to the mersacidin and the other was uncharacterized. Thus, the presence of genes involved in the biosynthesis of lantibiotics was investigated in the three strains selected. It was found that SL8, Sma1 and MO15 isolates contain the mersacidin structural gene. However, the mrsM gene, which encodes the mersacidin modification enzyme, was only amplified in SL8 and Sma1 strains. Moreover, no other lanM was identified in the MO15 isolate. Therefore, the presence of the mersacidin peptide in culture supernatants was investigated by MALDI-TOF/MS. However, this lantibiotic was not detected in any of the three supernatants. The present work opens perspectives for the identification of lantibiotics produced by the strains studied. Also, other studies will be carried out to characterize the peptides produced by all the isolates of the bacterial culture collection constructed in the present study.