Unveiling the APP role in cell migration

Abstract

A proteína precursora de amilóide de Alzheimer (PPA) é uma glicoproteína transmembranar com propriedades de adesão, descrita como reguladora positiva de migração celular. Embora ubíqua, a isoforma 695 da PPA está enriquecida no cérebro e pode funcionar na migração neuronal de novos neurónios que emergem de nichos neurogénicos existentes no cérebro adulto. No presente trabalho, objetivámos desvendar o papel da PPA e do seu fragmento secretado (sPPA) na migração celular, particularmente na migração de células do tipo neuronal, e os mecanismos moleculares subjacentes. Realizaram-se estudos de biologia celular em células SH-SY5Y humanas do tipo neuronal transfectadas com o cDNA de fusão PPA-GFP ou o vector EGFP, e sujeitas ao ensaio de ‘Scratch Wound Healing’ na presença ou ausência de sPPA. A eficiência de migração das células SH-SY5Y foi monitorizada a cada hora através de imagens de microscopia. O número de células migratórias recrutadas, e a distância e velocidade de migração da margem foram os parâmetros monitorizados nas células não transfectadas, para analisar o papel parácrino do sPPA. A coordenação, distância e velocidade de migração celular, e a distância migrada “fora-da-trajectória”, foram determinadas por análise da trajectória de cada célula transfectada, para estudar o papel autócrino da PPA transmembranar. A influência da PPA no fenótipo migratório e na distribuição da F-actina foram analisadas em células SH-SY5Y fixadas, e em condições ‘in vivo’ em células HeLa fluorescentes coexpressando PPA-GFP e um marcador fluorescente de F-actina (LifeAct-RFP). Estas células migratórias foram ainda sujeitas a análise por FRAP para estudar os efeitos da PPA na dinâmica do citoesqueleto de F-actina. Foi também avaliado o efeito da PPA na activação da Cdc42, um membro da família das Rho GTPases que regula a polarização celular e a formação de filopodia, influenciando assim o direcionamento da migração. Os nossos resultados mostram que o sPPA aumenta o número de células migratórias em períodos mais tardios, diminui a velocidade migratória da margem e aumenta a distância migrada “fora-da-trajectória”. A PPA transmembranar foi observada como tendo um papel na coordenação e persistência direcional da migração celular, numa forma dependente da desfosforilação do seu resíduo S655. Adicionalmente, análises morfológicas mostraram que a PPA ajuda as células a adquirir a distribuição de F-actina assimétrica polarizada característica de células migratórias. Os dados de FRAP sugerem que a PPA aumenta a estabilidade da F-actina quer na frente quer na traseira das células migratórias, aumentando a eficiência da migração celular uma vez que a adesão célula-substrato pode orientar a direccionalidade da migração. Finalmente, observámos que a PPA liga à Cdc42 e aumenta a sua ativação, outro mecanismo pelo qual a PPA pode determinar a migração direcionada. Estes resultados ajudam a desvendar os mecanismos moleculares subjacentes ao papel da PPA na migração celular, com potenciais aplicações no estudo da migração neuronal na neurogénese adulta.

The Alzheimer’s amyloid precursor protein (APP) is a transmembranar glycoprotein with adhesive properties, reported to positively regulate cell migration. Although ubiquitous, the APP 695 isoform is brain enriched and may function in neuronal migration of newly born neurons arising from adult brain neurogenic niches. In the present work we aimed to unveil the roles of APP and its secreted fragment (sAPP) in cell migration, particularly in neuronal-like migration, and the underlying molecular mechanisms. Cell biology studies were first performed in neuronal-like human SH-SY5Y neuroblastoma cells transfected with an APPGFP fusion construct or the EGFP vector, and subjected to the well-established ‘Scratch Wound Healing’ assay in the presence or absence of sAPP. The efficiency of SH-SY5Y cells migration was monitored every hour by microscopy imaging. The number of recruited migrating cells, and the leading-edge migration distance and velocity were the parameters monitored in nontransfected cells, to analyze the sAPP paracrine role. Cell coordination, migration distance and velocity, and “out-of-track” distance during cell migration, were determined by single-cell track analysis of transfected cells to study the autocrine role of full length APP. The influence of APP in the migratory phenotype and in F-actin distribution were analyzed in SH-SY5Y fixed cells, and in fluorescing HeLa cells co-expressing APP-GFP and a live Factin red fluorescent marker (LifeAct-RFP), by live cell imaging. These migrating cells were further subjected to FRAP analysis to study the APP effects on F-actin cytoskeleton dynamics. Finally, we also evaluated the effects of APP on the activation of Cdc42, a Rho GTPase family member that main regulates cell polarization and filopodia generation, influencing directional migration. Our results show that sAPP is capable to increase the number of cells recruited to migrate at later periods, but decreases the migratory velocity of the leading edge and increases the “out-of-track” migrated distance. Full-length APP was observed to have a role in the coordination and directional persistence of cells migration, in a S655-dephosphorylation dependent manner. Additionally, the morphological analyses showed that APP helps SH-SY5Y cells to acquire the polarized asymmetric F-actin distribution characteristic of migrating cells. FRAP data suggest that APP increases the stability of both front and rear F-actin of migrating cells, which may increase cell migration efficiency, as cell-substrate adhesion can guide the directionality of migration. Finally, we observed that APP binds to and enhances Cdc42 activation, another mechanism by which it can determine directional migration. These results help to unveil the molecular mechanisms underlying APP role in cell migration, with potential applications in the field of neuronal migration in adult neurogenesis.