Bioinformatic analysis of the neuronal phosphoproteome

Abstract

A fosforilação anormal de proteínas é uma das características chave da Doença de Alzheimer (DA) que pode estar envolvida tanto na patogénese como na progressão da doença. A fosforilação reversível de proteínas representa um importante mecanismo regulador que envolve a atividade de fosfoproteínas fosfatases (FPF) e proteínas cinases (PC). Um desequilíbrio intracelular entre a actividade de FPF e PC pode alterar a atividade, localização subcelular e interacções de proteínas, contribuindo para a desregulação da função e sinalização neuronal e, consequentemente para a neurodegeneração. Assim, o estudo do fosfoproteoma neuronal da DA tornase relevante tanto do ponto de vista fisiológico como patológico. Culturas primárias corticais foram expostas ao ácido ocadáico (AO, um inibidor de PPP) ou ao péptido β amilóide (Aβ) para mimetizar as condições da DA. Os lisados celulares foram aplicados numa coluna de afinidade para fosfoproteínas. As frações enriquecidas em fosfoproteínas foram analisadas por espetrometria de massa tendo sido desenvolvido um script em linguagem python (http://sourceforge.net/projects/protdb/) para análise das proteínas identificadas. Os resultados provenientes das condições Controlo vs AO indicam que o tratamento com este inibidor de FPF leva a um aumento do número de fosfoproteínas (174 vs 242 proteínas totais e 32 vs 100 proteínas exclusivas). Os resultados do tratamento com Aβ indicam uma alteração qualitativa do fosfoproteoma neuronal (174 vs 166 proteínas totais) com um número considerável de proteínas exclusivas (42 vs 34 proteínas exclusivas). Subsequentemente, para a obtenção de informação detalhada e caracterização das proteínas identificadas em cada condição, foi realizada uma análise exploratória das fosfoproteínas organizando-as por classe proteica, processos biológicos, localização subcelular e funções moleculares. Os tratamentos com AO e Aβ levam a alterações em proteínas envolvidas em processos celulares que se encontram comprometidos na DA, tais como a actividade das PC e FPF, degradação proteica, stress oxidativo, folding proteico, dinâmica do citoesqueleto, síntese proteica e apoptose. A caracterização do fosfoproteoma neuronal da DA pode revelar ou elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à transdução de sinais anormal associada com a patogénese da doença. A análise das fosfoproteínas exclusivas poderá, também, contribuir para a identificação de potenciais novos biomarcadores ou alvos terapêuticos para a DA.

Abnormal protein phosphorylation is a characteristic hallmark of Alzheimer’s disease (AD) and may be implicated both in pathogenesis or disease progression. Reversible protein phosphorylation represents a key regulatory mechanism involving the activity of protein phosphatases (PPP) and protein kinases (PK). Imbalanced PPP and PK activity can alter protein action, subcellular localization and protein interactions, thus contributing to abnormal neuronal function and signaling and consequently to neurodegeneration. Hence, the study of the AD neuronal phosphoproteome is of physiological and pathological relevance. Primary cortical cultures were exposed to okadaic acid (OA, a PPP inhibitor) or amyloid-β peptide (Aβ), in order to mimic AD conditions. Cell lysates were applied to a phosphoprotein affinity column and phosphoprotein enriched fractions analyzed by mass spectrometry. A protein database management framework (http://sourceforge.net/projects/protdb/) was set up allowing for the development of a script to analyze the identified proteins. Data from Control vs OA conditions indicates that OA treatment leads to an increase in phosphoproteins (174 vs 242 proteins and 32 vs 100 exclusive proteins). Data indicates that Aβ treatment leads to a shift in neuronal phosphoproteome pool (174 vs 166 proteins) with noteworthy alterations in the exclusive neurophosphoproteome (42 vs 34 exclusive proteins). Subsequently, analysis of the protein classes, biological processes, subcellular localization and molecular functions allowed for detailed information regarding the proteins obtained in the different groups. Upon treatments an alteration in the proteins involved in critical processes impaired in AD such as PK and PPP activities, protein degradation, oxidative stress, protein folding, cytoskeleton network dynamics, protein synthesis and apoptosis was observed. The characterization of AD neuronal phosphoproteome may reveal or elucidate the molecular mechanisms underlying abnormal signal transduction associated with AD pathogenesis. Further, by analyzing the pool of exclusive proteins, this work may also contribute to identify potential novel biomarker candidates or AD targets for therapeutic intervention.