Lipid profile of Leishmania infantum infected macrophages

Abstract

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infeciosa causada por algumas espécies do género Leishmania (L. infantum e L. donovani) que se revela particularmente problemática nas regiões tropicais e subtropicais. Uma vez no hospedeiro, os parasitas apresentam um grande tropismo para os macrófagos subvertendo as funções imunomoduladoras destas células. O estudo destes mecanismos de subversão foi durante largos anos focado na modulação a nível proteico, sendo dada pouca relevância ao efeito dos parasitas no perfil lipídico dos macrófagos. No entanto, devido ao crescente conhecimento acerca das funções imunomoduladoras dos lípidos, estes podem ser vistos como alvos terapêuticos promissores para o tratamento da leishmaniose. Deste modo, o objetivo geral deste trabalho consistiu na análise do perfil lipídico de macrófagos infectados com Leismania infantum, usando uma abordagem lipidómica, de modo a elucidar a contribuição de mudanças induzidas na patogénese da infeção. As diferentes classes de fosfolípidos foram separadas por TLC e quantificadas por através de um ensaio de fósforo e os ácidos gordos analisados por GC-FID. O extrato lipídico total foi analisado por espetrometria de massa de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC-MS e MS / MS), permitindo a identificação da estrutura detalhada dos fosfolípidos, nomeadamente da cabeça polar e composição dos ácidos gordos. O perfil fosfolipídico dos macrófagos revelou ser notoriamente alterado após a infeção tendo-se observado uma diminuição significativa no teor de PC e um correspondente aumento no conteúdo de LPC apenas em células infectadas com promastigotas viáveis. Verificou-se ainda que a infeção com parasitas viáveis causou uma diminuição no teor relativo de ácido palmítico e um aumento na razão de ácidos gordos C18/C16. Os resultados de HPLC-MS reforçaram estas observações, tendo evidenciado alterações consideráveis nos perfis de PC, LPC, PI e PS entre macrófagos, macrófagos expostos a promastigotas mortos ou viáveis. Avaliada a transcrição de genes relacionados com o metabolismo lipídico verificou-se um aumento nos níveis de ARNm dos genes Pla2gaf, Fabp4 e Elovl2, podendo justificar deste modo os aumentos previamente observados nos níveis de LPC e ácidos gordos C18. Por fim observou-se que os promastigotas possuem considerável atividade enzimática PLA2 e que esta atividade poderá estar relacionada com a entrada do parasita na célula facilitando a infeção.

Visceral leishmanisis (VL) is an infectious disease caused by protozoan parasites of the genus Leishmania (L. infantum and L. donovani) that raises great concerns particularly in tropical and subtropical regions. Once in the host, parasites have a tropism to macrophages and actively subvert the immunomodulatory functions of these cells. Little attention was put on the effect of parasites on macrophage’s lipid profile. However, due to the lipids biological significance they can be viewed as a promising therapeutic target for the treatment of leishmaniasis. Therefore, the general aim of this work is to use a lipidomic approach to analyze the lipidomic profile of Leishmania infantum infected macrophages in order to elucidate the contribution of induced changes in the pathogenesis of this infection. For this purpose, the different classes of phospholipids were separated by TLC and quantified by a phosphorous assay and the fatty acids were analyzed by gas chromatography with a flame ionization detector (GC-FID). The total lipid extract was analyzed by high-performance liquid chromatography mass spectrometry (HPLC-MS and MS/MS), allowing the identification of the detailed structure of phospholipids, namely the polar head and fatty acid composition. The phospholipid profile of macrophages was found to be markedly altered after infection since a significant decrease in the content of PC and a corresponding increase in the content of LPC were observed only in cells infected with promastigotes. Furthermore, it was also observed that infection with viable parasites caused a decrease in relative content of palmitic acid and an increase in the ratio of C18/C16 fatty acids. The results of HPLC-MS supported these findings and showed considerable changes in the profiles of PC, LPC, PI and PS between macrophages, macrophages exposed to viable or fixed promastigotes. The evaluation of the transcription of genes related to lipid metabolism showed an increase in mRNA levels of genes Pla2gaf, Fabp4 and Elovl2 thereby supporting the previous results regarding the increase in LPC levels and the increase of C18 fatty acids. Finally we found that promastigotes have considerable PLA2 enzyme activity and that this activity may be related to the parasite entry in the cell facilitating infection. abstract