Phenotypical tests to detect antibiotic resistance genes

Abstract

A disseminação da resistência a antibióticos é um grave problema de saúde pública que está a tomar proporções com efeitos difíceis de controlar. Nos últimos anos tem-se verificado que esta disseminação está associada com o fluxo de elementos genéticos móveis, como os integrões, os plasmídeos ou os transposões. Associados a estas estruturas, surgem frequentemente genes que codificam para beta-lactamases, cuja expressão confere resistência a antibióticos frequentemente usados na prática clínica. A causa desta disseminação ainda não é totalmente conhecida, contudo especula-se que possa estar associada ao uso de antibióticos, muitas vezes excessivo ou indevido. É um fenómeno atual, o facto de grande parte da população mundial estar envelhecida. Uma consequência óbvia deste facto, é o aumento de população envelhecida infetada com estirpes resistentes, o que dificulta a caracterização dos backgrounds genéticos existentes no hospital, visto este tipo de pacientes ter uma afluência ao hospital muito elevada. O recurso a testes fenotípicos, de resposta rápida e barata, em laboratórios hospitalares, torna-se cada vez mais necessário. Tendo por base a crescente necessidade de obtenção de resultados que levem a um tratamento mais direcionado, esta tese tem como objetivo principal a aplicação de testes fenotípicos para a deteção de beta-lactamases. Adicionalmente, foram comparadas metodologias existentes no mercado para a deteção de beta-lactamases de espectro alargado (ESBL) e beta-lactamases do tipo AmpC. Para este efeito, foram recolhidas estirpes de bactérias de Gram-negativo produtoras de beta-lactamases, de diferentes produtos biológicos, e compararam-se diferentes testes fenotípicos. Os resultados obtidos foram posteriormente confirmados por metodologias moleculares, pesquisando genes que codificam para beta-lactamases. A prevalência de Enterobacteriaceae produtoras de ESBL encontrada neste estudo é de 10% (n=498), que é preocupantemente elevada. Estas bactérias predominam nas mulheres (54%) e em crianças e idosos (num total de 78%). Os resultados obtidos mostraram que os testes fenotípicos que fazem a deteção de beta-lactamases, como o teste CicaBeta (MAST, UK), têm elevada sensibilidade (90%). Com testes fenotípicos que permitem uma identificação do tipo de beta-lactamase, como o MASTDISC Test (MAST, UK) e Etest (AB BioMérieux, Sweden), verificou-se uma sensibilidade de 94% e 96%, respetivamente. Os métodos moleculares confirmaram a presença de uma ESBL em 98% dos isolados, que na maior parte dos casos se verificou, usando metodologias moleculares, ser uma CTX-M-15. Existe uma elevada diversidade genética, tendo sido identificados 16 perfis genéticos diferentes e em 82% das estirpes foi identificado um integrão. A presença de isolados produtores de ESBL tem implicações devastadoras, pondo em causa o tratamento dos pacientes. Assim, a rápida deteção deste tipo de isolados torna-se imperativa, não só para a implementação de uma terapia adequada, mas também para monitorizar a disseminação de resistência.

The dissemination of antibiotic resistance is a serious problem, difficult to control and poses at risk public health. Several studies report that this dissemination is associated to mobile genetic elements flux, such as integrons, plasmids or transposons. Associated to these structures, are frequently genes coding for beta-lactamases, which expression confers resistance to antibiotics usually used in the clinic. The cause of this dissemination still is not fully known, however it is speculated that might be associated to the use and misuse of antibiotics. World population is aging. An obvious consequence of this fact is the increasing number of elderly infected with antibiotic resistant strains that attend to the emergency room (ER). Therefore the use of phenotypical tests, which give a fast and economic answer, in hospital laboratories, becomes increasingly necessary to achieve an effective treatment. The main goal of this thesis was the evaluation of phenotypical tests to detect extended-spectrum beta-lactamases (ESBL) and AmpC-like beta-lactamases. For this purpose, strains with an ESBL-producer phenotype were collected from different biological products, and the performance of different phenotypical tests was compared. The results obtained were subsequently confirmed by molecular methods. The prevalence of ESBL-producers Enterobacteriaceae found in this study of 10% (n=498) is concerningly high. These bacteria are prevalent in women (54%) and in the early and in elderly ages (in a total of 78%). The results obtained revealed that phenotypical tests that screen for beta-lactamases, as CicaBeta Test (MAST, UK), have a high sensitivity of 90%. Phenotypical tests that allow the identification of the type of beta-lactamase produced, such as MASTDISC Test (MAST, UK) and Etest (AB BioMérieux, Sweden) exhibited higher sensitivity, 94% and 96%, respectively. The molecular methods confirmed the presence of an ESBL in 98% of the isolates, which in most cases was found to be a CTX-M-15, using molecular methodologies. There is a high genetic diversity, being identified 16 different genetic profiles and in 82% of the strains was identified an integron. The clinical implications of strains carrying beta-lactamases, especially ESBLs and AmpC, are of enormous relevance and can compromise patient's treatment. Thus, the rapid detection of this type of isolates will allow the implementation of appropriate therapy, as well as monitor resistance dissemination.