Extração e estrutura dos polissacarídeos do resíduo do café com atividade imunoestimuladora

Abstract

As galactomananas das infusões de café apresentam atividade imunoestimuladora in vitro, sendo esta atividade semelhante à das mananas acetiladas extraídas de Aloe vera. As galactomananas presentes no resíduo de café também possuem atividade imunoestimuladora in vitro quando são parcialmente acetiladas. Como as galactomananas são o componente maioritário do resíduo de café e como o café é um produto de largo consumo a nível mundial, o reaproveitamento deste resíduo como fonte de galactomananas com atividade imunoestimuladora deve ser considerado. Esta dissertação procura dar resposta a duas questões: 1. Quais são as estruturas das galactomananas responsáveis pela atividade imunoestimuladora destes polissacarídeos; e 2. Como é que as galactomananas podem ser extraídas quantitativamente do resíduo de café de modo a serem solúveis em água à temperatura ambiente e, assim, poderem ser utilizadas como ingredientes alimentares com atividade imunoestimuladora. A questão 1 foi respondida pela caracterização estrutural de quatro galactomananas, de três origens: a) as galactomananas das infusões de café e do resíduo que apresentaram atividade imunoestimuladora; b) a galactomanana da goma de alfarroba (LBG), que não apresentou atividade imunoestimuladora; e c) a manana acetilada de Aloe vera, que apresentou atividade imunoestimuladora. Estes polissacarídeos foram submetidos à análise de açúcares e de ligações glicosídicas e a hidrólise por endo-β-D- (1→4)-mananase. Os fragmentos de oligossacarídeos mais pequenos foram ainda analisados por espetrometria de massa por ionização de electrospray e espetrometria de massa tandem. As galactomananas das infusões de café, do resíduo de café e do Aloe vera apresentaram grau de ramificação e peso molecular semelhantes, enquanto as galactomananas da LBG apresentaram grau de ramificação e de polimerização maiores. Todas as galactomananas apresentaram resíduos de arabinose como ramificação. O grau de acetilação das galactomananas da LBG foi vestigial enquanto as galactomananas do Aloe vera apresentaram um grau de acetilação de 2,08; para as galactomananas do resíduo de café o grau de acetilação foi de 0,98 e para as infusões foi de 0,08. A localização dos grupos acetilo foi irregular em todos os polímeros. Os resultados obtidos permitem inferir que baixos níveis de ramificação, cadeias pequenas e alguma acetilação parecem promover a atividade imunoestimuladora atribuída às galactomananas. Para responder à questão 2, foi testada uma metodologia que envolveu a torra do resíduo de café a 160 ºC e a 220 ºC e a sua extração com água quente e com soluções de 4 M NaOH à temperatura de 20, 60 e 120 ºC. A torra do resíduo a 160 ºC e a extração sequencial permitiu extrair 56% das galactomananas presentes no resíduo de café e, simultaneamente, 54% das arabinogalactanas. As galactomananas mantiveram a sua estrutura caraterística de polissacarídeo acetilado composto por uma cadeira principal de resíduos de manose em ligação β-(1→4) e resíduos de Gal e Ara nas cadeias laterais. A 220 ºC, as galactomananas foram parcialmente degradadas e o rendimento de extração foi muito menor do que a 160 ºC. No entanto, mesmo a esta temperatura as galactomananas apresentaram resíduos acetilados e a presença de pentoses nas cadeias laterais, o que permite inferir a elevada resistência destes polissacarídeos à temperatura e aos reagentes alcalinos. De forma a melhor compreender a estabilidade térmica das galactomananas do resíduo de café e a influência que a presença de arabinogalactanas pode ter na sua estabilidade, foi feita uma análise termogravimétrica aos polissacarídeos extraídos do resíduo de café assim como a polissacarídeos relacionados estruturalmente com estes, como a celulose, a galactomanana de LBG e a goma arábica, uma arabinogalactana. As galactomananas são termicamente estáveis durante 3 h a 200 ºC, enquanto as arabinogalactanas são estáveis a 180 ºC. De acordo com os perfis dos termogramas obtidos, e pelo cálculo das energias de ativação da degradação térmica, o resíduo de café apresenta uma estabilidade térmica menor do que a galactomanana, possivelmente devido à presença de arabinogalactanas. Apesar de não se ter verificado alterações no termograma da galactomanana do café submetida a um tratamento térmico de 200 ºC durante 3 h, verificam-se alterações estruturais que envolvem a formação de novas ligações glicosídicas, nomeadamente, a formação de resíduos de manose ligados em O-2 e em O-6, reações de transglicosilação, despolimerização, formação de resíduos de anidro-hexoses no terminal redutor e isomerização manose-glucose. Estas alterações promovem a solubilização das galactomananas. Os resultados obtidos permitem propor que o resíduo de café possa ser submetido a uma torra seguida de extração com reagentes alcalinos a quente para obtenção das galactomananas com rendimentos elevados. Estes polissacarídeos podem tornar-se solúveis em água após tratamento térmico a 200 ºC, permitindo assim a sua utilização em formulações alimentares, nomeadamente, por preparação de compostos acetilados com baixos níveis de ramificação e cadeias pequenas de modo a promover a sua atividade imunoestimuladora.

The coffee infusion galactomannans present in vitro immunostimulatory activity. These polysaccharides present a similar activity to the acetylated galactomannans of Aloe vera. The galactomannans extracted from coffee byproduct, when partially acetylated, also present in vitro immunostimulatory activity. As the galactomannans are the main components of coffee residue, and because the coffee is a product largely consumed all over the world, the reutilization of the residue as a source of galactomannans with immunostimulatory activity required to be considered. The present PhD thesis tries to answer two questions: 1. What the galactomannans structures responsible for the immunostimulatory activities of these polysaccharides are; and 2. How can the galactomannans be quantitatively extracted from coffee residue to be rendered soluble in water at room temperature and, thus, be used as food ingredients with immunostimulatory activity. Question 1 was answered performing the structural characterisation of four galactomannans from three different origins: a) coffee infusion and coffee residue galactomannans presenting immunostimulatory activity; b) locust bean gum (LBG) galactomannan not presenting immunostimulatory activity; and c) Aloe vera acetylated galactomannan presenting immunostimulatory activity. These polysaccharides were submitted to sugar and glycosidic-linkage analyses and were hydrolysed by an endo-β-D-(1→4)-manannase. The oligosaccharide fragments were also analysed by electrospray-ionization mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Coffee infusion, coffee residue, and Aloe vera galactomannans presented similar degree of branching and molecular weight whereas LBG galactomannans presented higher degree of branching and molecular weight. All galactomannans present arabinose residues as branching side chains. The acetylation degree of LBG galactomannans approached zero whereas Aloe vera galactomannans presented an acetylation degree of 2.08, coffee residue galactomannans presented 0.98, and coffee infusion galactomannans presented an acetylation degree of 0.08. The location of the acetyl groups was irregular in all polymers. The results obtained allowed to infer that low branching, short chains and some acetylation seem to promote the immunostimulatory activity attributed to the galactomannans. ix To answer to question 2, a methodology using the roasting of the residue at 160 ºC and at 220 ºC and its extraction with hot water and 4 M NaOH solutions at 20, 60, and 120 ºC was tested. The roast of the residue at 160 ºC and the sequential extraction allowed the extraction of 56% of the coffee residue galactomannans and, simultaneously, 54% of the arabinogalactans. The galactomannans kept their characteristic structure of acetylated polysaccharide composed by a backbone of β-(1→4)-linked mannose residues and Gal and Ara residues as side chains. At 220 ºC, the galactomannans were partially degraded and the yield of extraction was much lower than at 160 ºC. Nevertheless, even at this temperature, the galactomannans presented acetylated residues as well as pentose residues as side chains. These observations allowed to infer that these polysaccharides are highly resistant to high temperatures and alkali reagent conditions. In order to better understand the thermal stability of coffee residue galactomannans and the influence of the presence of arabinogalactans in galactomannans stability, a thermogravimetric analysis was performed using the coffee residue polysaccharides as well as structural related polysaccharides such as cellulose, LBG galactomannan and gum Arabic, an arabinogalactan. The galactomannans are thermally stable during 3 h at 200 ºC, whereas the arabinogalactans are stable at 180 ºC. According to the thermogravimetric profiles obtained, and by the calculation of the activation energy of thermal decomposition, the coffee residue presented a lower thermal stability then the galactomanans, possibly due to the presence of the arabinogalactans. Although no changes in the coffee galactomannan thermogram were observed upon a thermal treatment at 200 ºC during 3 h have been observed, structural changes involving the formation of new glycosidic linkages, namely, the formation of mannose residues O-2 and O-6 linked, transglycosilation reactions, depolymerization, formation of anhydrohexose residues on the reducing end, and mannose-glucose isomerization have been observed. These changes promoted galactomannan solubilisation in cold water. The results obtained allow to propose that coffee residue can be submitted to a roasting followed by an hot alkali extraction to obtain galactomannans in high yield. These polysaccharides can be soluble in cold water upon thermal treatment at 200 ºC, allowing their use in food formulations, namely, by preparation of acetylated compounds, low branched and with short chains in order to promote their immunostimulatory activity.