Avaliação do efeito de metais pesados na fertilidade do ratinho

Abstract

A infertilidade é um problema actual que afecta cerca de 8 a 12% dos casais em idade fértil, sendo 50% dos casos atribuídos ao factor masculino. A exposição ocupacional e/ou ambiental a metais pesados representa uma das suas principais causas. O chumbo, o cádmio e o crómio são metais com elevada utilização industrial e muito persistentes no ambiente, sendo motivo de grande preocupação devido aos seus efeitos na saúde reprodutiva dos trabalhadores e da população em geral. Neste trabalho estudaram-se os efeitos do cloreto de chumbo (PbCl2), cloreto de cádmio (CdCl2) e cromato de potássio (K2CrO4) na fertilidade, usando como modelo ratinhos machos ICR-CD1. Os ratinhos foram injectados subcutaneamente com 74 e 100 mg de PbCl2/kg pc ou com 5 e 10 mg de K2CrO4/kg pc, respectivamente, durante 4 dias consecutivos ou com 1, 2 e 3 mg de CdCl2/kg pc numa única injecção. Nos ensaios com PbCl2 e K2CrO4 os animais foram sacrificados 5 e 35 dias após o início da exposição, enquanto que nos ensaios com CdCl2 os animais foram sacrificados após 24 horas e 35 dias. O cloreto de chumbo não alterou a histologia do testículo nem do epidídimo, mas induziu um aumento da percentagem de células em fase S no testículo. O cloreto de chumbo alterou também alguns parâmetros dos espermatozóides, tais como a motilidade, morfologia e integridade do acrossoma. Contudo, não foram observados efeitos na integridade do DNA ou na estrutura da cromatina. O cloreto de cádmio induziu lesões severas e não reversíveis nos testículos que, após 35 dias, reverteram em necrose testicular. O cloreto de cádmio alterou ainda as subpopulações de células testiculares após 24 horas e induziu IMS no testículo após 35 dias. Em consequência das lesões no testículo, a densidade espermática foi severamente afectada após 35 dias. A exposição ao cloreto de cádmio afectou também a morfologia, a motilidade e a integridade acrossómica nos espermatozóides. O cloreto de cádmio induziu ainda fragmentação do DNA nestas células após 35 dias. O cromato de potássio alterou a morfologia dos espermatozóides e a integridade do acrossoma, sobretudo nos animais sacrificados após 35 dias. Verificou-se ainda uma redução da motilidade dos espermatozóides. Não foram detectados efeitos genotóxicos nos espermatozóides, devido à acção do K2CrO4 nas doses testadas. Dos parâmetros avaliados neste trabalho, destacam-se duas novas abordagens, nomeadamente o programa informático Snakes e a análise do conteúdo em DNA de células de testículo, a partir de material incluído em parafina. O Snakes permitiu fazer medições rigorosas do diâmetro dos tubos seminíferos, enquanto que a fixação de amostras de testículo de ratinhos em formol tamponado e inclusão em parafina resultou numa boa preservação do DNA, possibilitando assim a quantificação das subpopulações de células testiculares por citometria de fluxo. Os resultados obtidos para os diferentes parâmetros testados indicam que a motilidade dos espermatozóides e a integridade do acrossoma sejam parâmetros sensíveis à toxicidade de metais. O acrossoma aparenta ser um dos principais alvos da toxicidade dos metais e cuja reacção acrossómica prematura pode reduzir a capacidade do espermatozóide para fertilizar o oócito. Assim, este trabalho representa uma contribuição para uma melhor compreensão dos efeitos do chumbo, cádmio e crómio na fertilidade masculina.

Infertility is a nowadays major concern that affects about 8 to 12% of the couples and the male factor contributes for about 50% of the cases. Occupational and/or environmental exposure to heavy metals represents one of the major causes of male infertility. Lead, cadmium and chromium are heavy metals widely used in industry and quite persistent in the environment, raising major concerns over the possible effects on the reproductive health of workers and the general population. In the present work, the effects on fertility of lead chloride (PbCl2), cadmium chloride (CdCl2) and potassium chromate (K2CrO4) were studied using male ICR-CD1 mice as a model. Mice were subcutaneously injected with 74 and 100 mg PbCl2/kg bw or 5 and 10 mg K2CrO4 for four consecutive days, or 1, 2 and 3 mg CdCl2 in a single injection. In PbCl2 and K2CrO4 assays, animals were sacrificed 5 and 35 days after the beginning of the experiment, while in CdCl2 assays the animals were sacrificed after 24 hours and 35 days. Lead chloride did not induce histological changes on testis or epididymis, but induced an increase in the percentage of cells on S phase in the testis. Lead chloride also changed sperm parameters such as motility, morphology and acrosome integrity. However, no effects on sperm DNA integrity or chromatin structure were observed. Cadmium chloride induced severe and irreversible lesions on mice testis, which resulted on testicular necrosis after 35 days. Cadmium chloride also changed testicular cell subpopulations after 24 hours and induced microsatellite instability on testis after 35 days. As a consequence of testicular lesions, sperm density was severely affected after 35 days. Cadmium chloride exposure also changed sperm morphology, motility and acrosome integrity. Moreover, this compound also induced sperm DNA fragmentation 35 days after exposure. Potassium chromate changed sperm morphology and acrosome integrity more pronounced on mice sacrificed after 35 days. A decrease on sperm motility was also observed. However, no genotoxic effects were detected on sperm after K2CrO4 exposure. Amongst the array of assays performed in this work, two new approaches were developed and can be highlighted, namely the Snakes software and analysis of DNA content from paraffin embedded testicular samples. Snakes allowed accurate measurements of diameter of seminiferous tubules, while buffered formalin fixation and paraffin embedding of mice testicular samples allowed good DNA preservation, enabling the quantification of testis cells subpopulations by flow cytometry. Taken together the results obtained with the different parameters tested indicate that sperm motility and acrosome integrity are sensitive to metal toxicity. The acrosome appears as a main target to metal toxicity, and its premature reaction may reduce the ability of sperm to fertilize the oocyte. Thus, this work contributes to a better understanding of lead, cadmium and chromium effects on male fertility.