Interacção in vitro entre Quercus suber L. e Phytophthora cinnamomi Rands

Abstract

Este trabalho circunscreve-se na área da fitopatologia e tem por objectivo principal a contribuição para o levantamento de alguns mecanismos relacionados com a resistência e a susceptibilidade de Quercus suber ao agente etiológico Phytophthora cinnamomi. Para a iniciação de culturas in vitro de Q. suber propõe-se uma abordagem de desinfecção superficial por aplicação de Peróxido de Hidrogénio. Tanto do ponto de vista quantitativo, como qualitativo, este método produziu resultados melhores em termos de indução e manutenção de porções aéreas e de tecido caloso de Q. suber in vitro (p < 0,001) e taxas de descontaminação sempre superiores a 88,8%. Os tecidos vegetais cresceram melhor em meio nutritivo de Gresshoff e Doy modificado. Por aplicação de uma combinação de dois métodos para produção de zoósporos e duas estirpes patogénicas, obtiveram-se suspensões de zoósporos de P. cinnamomi. O método se CHAMBERS et al. (1995) e a estirpe H1000 contribuíram com os melhores resultados (104 zoósporos.mL-1). A infecção das culturas (plântulas micropropagadas, porções aéreas e tecido caloso) forneceu quadros sintomatológicos de infecção em tudo semelhantes ao que sucede na interacção in vivo. Foram eleitos entre os clones de tecido caloso disponíveis um resistente (proveniente de Montemor-o-Novo) e um susceptível (proveniente de Ponte-de-Sôr). Foram analisados alguns parâmetros químicos e bioquímicos (Cl- , SO4 2-, NO3 - , NO2 - , HPO4 3-, F- , ião oxalato, Na+ , K+ , NH4 + , Mg2+, Ca2+ por electroforese capilar e perfis peptídicos em electroforese de geles de poli-acrilamida em condições desnaturantes) após a interacção do tecido caloso (a crescer em meios com diferentes composições hormonais) com os zoósporos de P. cinnamomi. Na presença do agente patogénico as quantidades dos iões NH4 + , NO2 - , NO3 - e F- eram vestigiais, dos iões K+ , Ca2+ e Na+ diminuíam, do ião Mg2+ mantinhamse, mais ou menos estáveis, dos iões Cl- e SO4 2- diminuíam no tecido resistente e mantinham-se constantes no tecido susceptível, e do anião HPO4 2- mantinham-se constantes no tecido resistente e diminuíam no tecido susceptível. Para o tecido susceptível os ganhos em número de bandas são maiores entre os 205-100 kDa e para o tecido resistente entre os 13-5 kDa. Nos pesos moleculares entre 100-60 kDa, 60-40 kDa e 40-13 kDa, o número de bandas é sempre superior no tecido resistente e este é o que apresenta maiores perdas ao longo da interacção. Correlacionando o número de bandas dos perfis peptídicos com as concentrações em iões foram obtidas três correlações positivas (Mg2+/40-13 kDa; Cl- /100-60 kDa e Cl- /60-40 kDa) e duas negativas (K+ /13-5 kDa e Oxalato/205-100 kDa). Neste modelo de interacção foi encontrada maior relevância nas variações do número de bandas nos perfis peptídicos (60-40 kDa>40-13 kDa>100-60 kDa>205-100 kDa>13-5 kDa), seguida da relevância dos catiões (K+ >Na+ >Mg2+>Ca2+) e dos aniões (SO4 2->Cl- >HPO4 2 ). Igualmente relevante o número de bandas entre 13 a 5 kDa e a concentração em ião oxalato (com contributos com 52,08% e 60,99%, respectivamente).

This is a work in the area of the phytopathology and the main goal is to contribute to the finding of some mechanisms related to the resistance and the susceptibility of Quercus suber to the pathogen Phytophthora cinnamomi. To initiate Q. suber in vitro cultures the application of hydrogen peroxide as a superficial disinfection agent is proposed. This method was better from the qualitative and quantitative point of view to the induction and maintenance of Q. suber in vitro cultures (p < 0,001) and the decontamination level was over 88%. The tissues grew better in modified Gresshoff and Doy medium. P. cinnamomi zoospores suspensions were obtained by combining two zoospores production methods and two pathogenic isolates. The bests results were achieved with CHAMBERS et al. (1995) method and H1000 isolate (104 zoospores.mL-1). The infection of the cultures (micropropagated plantlets, shoots and calli) showed several symptomatologic degrees of infection comparable to the in vivo interaction. One calli clone resistant (from Montemor-o-Novo) and other susceptible (from Ponte-de-Sôr) were elected from the available clones. Some chemical and biochemical parameters (Cl - , SO 4 2-, NO 3 - , NO 2 - , HPO 4 3-, F - , oxalate ion, Na + , K + , NH 4 + , Mg2+, Ca2+ by capillary electrophoresis and the polypeptide profile determination by denaturant polyacrilamide gels electrophoresis) were analysed after calli cultures (growing in different hormonal compositions) and P. cinnamomi zoospores interaction. In the presence of the pathogen the quantities of NH 4 + , NO 2 - , NO 3 - and F- ions were almost nulls, K + , Ca2+ and Na+ ions diminished, Mg2+ ion maintained more or less stable, Cl - and SO 4 2- ions diminished in the resistant tissue and maintained constant in the susceptible tissue, and HPO 4 2- ion maintained constant in the resistant tissue and diminished in the susceptible tissue. Gains in the number of bands in the challenged susceptible tissue were grater between 205-100 kDa and in the susceptible tissue between 13-5 kDa. The number of bands in the molecular weights between 100-60 kDa, 60-40 kDa and 40-13 kDa was always superior in the resistant tissue and this always showed grater losses along the interaction. By correlating the number of band obtained in SDS PAGE with the ion concentrations we obtained tree positive correlations (Mg2+/40-13 kDa; Cl - /100-60 kDa and Cl - /60-40 kDa) and two negative correlations (K + /13-5 kDa and Oxalate/205-100 kDa). In this interaction model grater relevancy was found in the polypeptide profile bands numbers variations (60-40 kDa > 40-13 kDa > 100-60 kDa > 205-100 kDa > 13-5 kDa), followed by the relevancy of the cations (K + > Na + > Mg2+ > Ca2+) and of the anions (SO 4 2- > Cl - > HPO 4 2 ). The band number between 13-5 kDa and the oxalate concentration were equally important (with 52,08% and 60,99% contributions, respectively).