Evaluating the effects of Abeta using a synaptosomal model

Abstract

A Doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela presença de placas senis extracelulares (PSs), compostas principalmente pelo péptido Abeta, pelas tranças neurofibrilhares intracelulares (TNFs) compostas pela Tau hiperfosforilada, e pela disfunção sináptica. Assim, na DA estão envolvidas proteínas cuja expressão está alterada como a proteína precursora de amilóide de Alzheimer (PPA) e Tau, sendo a análise proteómica destas proteínas de grande importância para o estudo da patologia em questão. A possibilidade de estudar a sinapse, assim como o seu conteúdo proteico através dos sinaptossomas constitui um modelo muito atrativo, uma vez que as suas características morfológicas e funcionais são preservadas após o isolamento. No presente estudo, foram testadas duas metodologias distintas para isolar sinaptossomas, o protocolo de gradiente de Percoll e o protocolo de gradiente de sacarose. Da análise bioquímica desses protocolos verificou-se que o protocolo de gradiente de sacarose é mais eficiente, tendo sido aplicado nos diferentes ensaios realizados. De modo a avaliar os efeitos do Abeta na fosforilação anormal de proteínas envolvidas na DA, neste estudo foram analisados os efeitos do Abeta na fosforilação da PPA e Tau, nos resíduos Thr668 e Ser262, respectivamente. Verificou-se que nas fracções sinaptossomais de córtex e hipocampo o Abeta provoca um aumento da fosforilação da PPA e da Tau nos resíduos em estudo, principalmente nas concentrações mais elevadas. Adicionalmente, e sabendo que a DA pode resultar do mau funcionamento de proteínas cinases e fosfatases, que podem levar à desregulação de vias de transdução de sinal, é também importante determinar quais dessas cinases e fosfatases estão envolvidas na desfosforilação dos resíduos Thr668 na PPA e Ser262 na Tau. Neste estudo, através da utilização de inibidores de fosfatases, o ácido ocadeico (AO) e a cantaridina (CT), observou-se um envolvimento da PP1 na desfosforilação da PPA e da Tau. No seu conjunto, os resultados obtidos sugerem que o Abeta pode estar envolvido na alteração de vias de sinalização que culminam na Doença de Alzheimer.

Alzheimer´s disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by the presence of extracellular senile plaques (SP) mainly composed by betaamyloid peptide (Abeta), intracellular neurofibrillary tangles (NFTs) comprising hyperphosphorylated Tau and by synaptic dysfunction. Thus AD involves altered expression of some proteins, like Alzheimer´s Amyloid Precursor Protein (APP) and Tau, and therefore proteomic studies are of paramount importance for AD pathology. The possibility to investigate the synapse and their proteomic content using synaptosomes is a very attractive model since they preserve morphological and functional characteristics of synapse. In the present study, were tested two different methodologies: Percoll gradient protocol and sucrose gradient protocol to isolate synaptosomes, and it was shown that sucrose gradient protocol is more effective, being this protocol chosen to perform the following experiments. Due to the key role played by Abeta and abnormal protein phosphorylation in AD, in this study we analyzed the Abeta effects on APP and Tau phosphorylation, at Thr668 and Ser262 residues, respectively. We verified an increase in APP and Tau phosphorylation at these specific residues, for both cortical and hippocampalsynaptosomal enriched fractions, upon Abeta treatment, specially with higher concentrations. Additionally, and knowing that possibly AD is caused by protein kinases (PKs) and protein phosphatases (PPs) imbalance, which alters crucial signal transduction pathways, therefore is very important to establish the PPs involved in APP (Thr668) and Tau (Ser262) dephosphorylation. We observed an involvement of PP1 on APP and Tau dephosphorylation. Taken together, these findings suggest that Abeta could deregulate some signaling cascades leading to Alzheimer´s disease.