Efeito da translocação catiónica mediada por vesículas sinápticas na neurotransmissão

Abstract

O transporte de cálcio pelas vesículas sinápticas regula a duração da neurotransmissão: Como partir de uma actividade para chegar a uma função biológica e à identificação da proteína que a confere. A neurotransmissão rápida ocorre na escala de tempo do milisegundo. Esta inclui I) A entrada rápida de Ca2+ para dentro da célula através dos canais de cálcio sensíveis a voltagem. II) A activação do mecanismo de libertação de neurotransmissor sensível a cálcio. III) A difusão através da fenda sináptica IV) A activação dos receptores pós-sinápticos V) A terminação da sinalização Um dos acontecimentos chave neste processo é que a elevação da concentração de Ca2+ no terminal sináptico tem de ser transitória, suficientemente elevada para garantir que a secreção ocorra num ápice e não perdure no tempo de modo a comprometer a “janela de tempo” da secreção (< 300 μs). A necessidade de um mecanismo de sequestração rápida de Ca2+ de baixa afinidade foi postulado no passado como pressuposto teórico para garantir uma elevação da [Ca2+]i > 100 μM durante menos de 300 μs. No nosso laboratório foi identificada uma tal actividade de transporte de Ca2+ energizada pelo gradiente de protões vesicular. Um trocador de Ca2+/H+ em vesículas sinápticas de córtex cerebral de carneiro, activo para uma gama de concentrações de Ca2+ relativamente elevada, entre os 100 e os 800 μM (máxima actividade aos 500 μM). A velocidade do transporte de Ca2+ por este antiporta depende do gradiente de H+ através da membrana vesicular que é mantido pela actividade da H+-ATPase do tipo V e passível de ser inibida especificamente pela bafilomicina A1. Também o ião Sr2+ inibe o trocador de Ca2+/H+ (sem afectar o gradiente de H+ vesicular). Estes dois inibidores foram utilizados para por em evidência a participação do trocador de Ca2+/H+ vesicular na regulação da secreção da acetilcolina (ACh) nas sinapses do órgão eléctrico de Torpedo marmorata. Quer o Sr2+, prevenindo a sequestração vesicular de iões, quer a bafilomicina, que dissipa o gradiente de H+, induziram um aumento no tempo de resposta pós-sináptica de 2 ms para até ~10 ms, devido à persistência da libertação de ACh. Os electrócitos do órgão eléctrico de Torpedo permitiram acompanhar esta libertação de ACh em tempo real através da medição da corrente eléctrica gerada pelo órgão eléctrico em resposta à ACh. Esta preparação permitiu simultaneamente a marcação da ACh libertada com 14C, evidenciando assim a natureza pré-sináptica do aumento da libertação de ACh. Este aumento foi ainda confirmado em sinaptossomas isolados a partir do mesmo órgão, desta vez utilizando a quimioluminescência como técnica de visualização da libertação de ACh. Ficou demonstrado que a principal função do antiporte de Ca2+/H+ vesicular é a de restringir, no tempo, a libertação de neurotransmissor. Não se exclui, contudo, que essa mesma sequestração participe igualmente na homeostasia do Ca2+ “ajudando” a acção da Ca2+-ATPase vesicular a manter os níveis basais de Ca2+. Agora que sabíamos o que o antiporte faz queríamos saber qual a proteína que o codificava. Para tal partimos da hipótese que a sinaptotagmina I codificava o nosso transportador. Usámos clones de células PC-12 em cultura que não exprimiam a sinaptotagmina (-/-) e comparámos a actividade de antiporte vesicular dessas células com a actividade nas células exprimindo a proteína (+/+). A perda de actividade nas células -/- foi de 100% relativamente às +/+. De modo a certificarmo-nos deste resultado usámos células -/- transfectadas com o gene da sinaptotagmina I ao qual foi fusionada uma sequência tetracisteínica (Cis-Cis-Arg-Glu-Cis-Cis) na proteína de fusão. Esta sequência é capaz de reconhecer uma sonda biarsénica, fluorescente quando ligada à proteína de fusão, e passível de criar radicais livres de alta reactividade (singletos de oxigénio) quando exposta a luz ultravioleta de alta intensidade. Técnica conhecida por “fluorescein-assisted light inactivation” ou FlAsh- FALI. Por este método pudemos verificar que a actividade de antiporte de Ca2+/H+ vesicular requer uma sinaptotagmina I funcional, usando ensaios de transporte de 45Ca2+ e uma sonda fluorescente sensível a protões.

Calcium transport by synaptic vesicles shapes neurotransmission timing: From an activity to the biological function and the identification of it’s encoding protein. Rapid neurotransmission occurs in the millisecond timescale. This includes: I) Fast Ca2+ entry into the cell through voltage operated calcium channels II) Activation of the Ca2+-sensitive neurotransmitter release mechanism III) Diffusion through the synaptic cleft IV) Post-synaptic receptor activation V) Signalling termination One of the key features in this process is that the Ca2+ concentration rise in the synaptic terminal must be transitory in nature. Rise above threshold level to guarantee flash-like secretion and don’t endure in time as to compromise the time window for release (< 300 μs). The need for a rapid Ca2+-sequestering mechanism was postulated in the past as a theoretical pre-requisite to guarantee [Ca2+]i> 100 μM in less than 300 μs. We identified one such activity of Ca2+-transport, energized by the vesicular proton gradient. A Ca2+/H+ exchanger in synaptic vesicles of sheep brain cortex. Active for rather high Ca2+ concentrations ranging from 100 to 800 μM (maximum activity at 500 μM). The speed of Ca2+ transport by this antiport depends on the H+ gradient existent across the vesicular membrane. This is maintained by the activity of a V-type-H+-ATPase specifically inhibited by bafilomycin A1. Also, Sr2+ can inhibit the Ca2+/H+ exchange (without affecting the vesicular H+ gradient). These two inhibitors were used to put in evidence the participation of this Ca2+/H+ exchanger in the tight control of acetylcholine secretion (ACh) in Torpedo marmorata electric organ synaptic vesicles. Both Sr2+, by preventing vesicular ion sequestration, and bafilomycin, able to annihilate the H+ gradient, induced an increase in time of the post-synaptic response from 2 ms up to ~10 ms, due to the persistence of ACh release. Torpedo marmorata’s electric organ electrocytes enabled us to follow ACh release in real time by registering the electric current generated by the electric organ in response to ACh. This preparation allowed the simultaneous marking of the ACh being released with 14C, putting in evidence, in this way, the pre-synaptic nature of ACh release increase. This ACh rise was also confirmed in synaptosomes isolated from the same organ, this time using the technique of chemiluminescence to visualize ACh release. It was demonstrated that the main function of the vesicular Ca2+/H+ antiport is to restrain in time neurotransmitter release. However, we cannot exclude that such sequestration participates equally in Ca2+ homeostasis by “helping” the action of vesicular Ca2+-ATPases to maintain basal Ca2+ low. Now that we knew what the antiport does, we aimed at identifying the protein that codes for it. To do so, we started from the hypothesis that synaptotagmin I coded for our transporter. We cultured PC12 cell clones that did not expressed synaptotagmin I (-/-) and compared the vesicular antiport activity of those cells against that of positive control cells (+/+). To be certain of the result we used -/- cells to be transfected with the gene for protein synaptotagmin I fused with a tetracysteine sequence (Cis-Cis- Arg-Glu-Cis-Cis) in the resulting fusion protein. This sequence is responsible for the recognition of a biarsenical probe, able to fluoresce when bound to the fusion protein and liable to generate high reactivity free radicals (oxygen singlets) when exposed to intense UV light. That is, the fluorescein-assisted light inactivation or FlAsh-FALI. This method enabled us to conclude that the Ca2+/H+ antiport activity requires a functional synaptotagmin I, as assessed by 45Ca2+ transport assays and a fluorescence probe sensitive to protons.