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http://hdl.handle.net/10773/939
Title: | Molecular evolution of a genetic code alteration |
Author: | Gomes, Ana Catarina Batista |
Advisor: | Santos, Manuel António da Silva |
Keywords: | Biologia Código genético Alterações genéticas RNA |
Defense Date: | 2008 |
Publisher: | Universidade de Aveiro |
Abstract: | Durante os últimos anos, foram descritas alterações ao código genético, quer em
procariotas, quer em eucariotas, quebrando o dogma de que o código genético é
universal e imutável. Estudos recentes sugerem que a evolução de tais alterações
requerem modificações ao nível da estrutura da maquinaria da tradução e são
promovidas por mecanismos de descodificação ambígua. Em C. albicans, um
organismo que é patogénico para o Homem, a alteração ao código genético é mediada
por uma alteração na estrutura de um novo tRNACAG de serina que descodifica o codão
CUG de leucina como serina.
De forma a determinar se este tRNA, que é aminoacilado pelas Seryl- e Leucyl- tRNA
sintetases, promove a descodificação ambígua do codão CUG, foi desenvolvido um
sistema para a quantificar in vivo, por espectrometria de massa, os níveis de
incorporação de serina e de leucina em codões CUG. Os resultados mostraram que em
condições normais de crescimento leucina é incorporada a uma taxa de 3% e que serina
é incorporada a uma taxa de 97%. No entanto, o nível de ambiguidade na
descodificação de codões CUG aumentou para 5% em células crescidas em condições
de stress, indicando que a incorporação de leucina em codões CUG é sensível a factores
ambientais e é manipulada durante a tradução do mRNA. Tal, levanta a hipótese de que
a incorporação de leucina poderá atingir níveis superiores aos determinados neste
estudo. Para testar esta hipótese e determinar os níveis máximos de ambiguidade na
descodificação do codão CUG tolerados pelas células, aumentou-se artificialmente a
ambiguidade do codão CUG em C. albicans. Surpreendentemente, a incorporação de
leucina subiu de 5% para 28%, o que representa um aumento na taxa de erro da
tradução de 3500 vezes, relativamente ao descrito para o mecanismo de tradução.
Dado existirem 13.000 codões CUG no genoma de C. albicans, a sua descodificação
ambígua expande de uma forma exponencial o proteoma deste fungo, criando assim um
proteoma estatístico, resultante da síntese de um conjunto de moléculas diferentes para
cada proteína a partir de um único RNA mensageiro (mRNA) que contenha codões
CUG.
Os resultados obtidos demonstraram que o proteoma de C. albicans tem uma dimensão
muito superior à prevista pelo seu genoma e demonstram um papel central da
descodificação ambígua na evolução do código genético. Alterations to the standard genetic code have been found in both prokaryotes and eukaryotes, demolishing the dogma of an immutable and universal genetic code. Recent studies suggest that evolution of such alterations require structural change of the translation machinery and are driven through mechanisms that require codon decoding ambiguity. In the human pathogen C. albicans, a structural change in a novel sertRNACAG allows for its recognition by both the LeuRS and SerRS in vitro and in vivo, providing such molecular device. In order to determine whether this tRNA charging ambiguity results in ambiguous CUG decoding, we have developed a system for quantification of the level of serine and leucine at the CUG codon by Mass-Spectrometry. The data showed that 3.0% of leucine and 97.0% of serine are incorporated at CUG codons in vivo under standard growth conditions. Moreover, this ambiguity increases up to 5.0% under stress, indicating that it is sensitive to environmental change and raising the hypothesis that leucine incorporation may be higher than determine experimentally. In order to determine the scope of C. albicans tolerance to CUG ambiguity, we have created highly ambiguous C. albicans cell lines through tRNA engineering. These cell lines tolerated up to 28% leucine incorporation at CUGs, which represents an increase of 3500 fold in decoding error rate. Since there are 13,000 CUG codons in C. albicans such ambiguity expands the proteome exponentially and creates a statistical proteome due to synthesis of arrays of protein molecules from mRNAs containing CUG codons. The overall data showed that the dimension of the C. albicans proteome is far higher than that predicted from its genome and provides important new evidence for a pivotal role for codon ambiguity in the evolution of the genetic code. |
Description: | Doutoramento em Biologia |
URI: | http://hdl.handle.net/10773/939 |
Appears in Collections: | DBio - Teses de doutoramento UA - Teses de doutoramento |
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