Characterization of two novel protein phosphatase 1 regulators : I2L and NEK2C

Abstract

A infertilidade masculina tem vindo a assumir proporções preocupantes na nossa sociedade. Há inúmeros factores que contribuem para esta condição, incluindo problemas associados à motilidade dos espermatozóides. As bases moleculares da motilidade dos espermatozóides ainda não foi completamente desvendada, contudo a incubação de espermatozóides imaturos imóveis com inibidores de proteínas fosfatases induz a sua motilidade. A fosforilação de proteínas é, então, fundamental na regulação da motilidade dos espermatozóides. A fosforilação de proteínas é um dos principais mecanismos reguladores de cascatas de transdução de sinais em organismos eucariotas. Os mecanismos dinâmicos e reversíveis de fosforilação/desfosforilação são catalizados pelas proteínas cinases e pelas proteínas fosfatases, respectivamente. A PP1, uma fosfatase específica para serina/treonina, está envolvida no controlo da motilidade dos espermatozóides, e noutras funções nos testículos. Nas células somáticas, a PP1 está envolvida em diversos mecanismos, que incluem o controlo do ciclo celular, a contracção muscular, a expressão de genes, a actividade neuronal e o metabolismo do glicogénio. A especificidade da função da PP1 depende das proteínas reguladoras que interagem com a sua subunidade catalítica, direccionando-a para um dado substrato ou para uma determinada localização subcelular, e/ou modificando a sua actividade em relação ao substratos. Actualmente conhecem-se mais de cinquenta subunidades reguladoras da PP1, não relacionadas bioquimicamente. A diversidade da PP1 também se deve à expressão de várias isoformas: existem três genes que codificam a PP1 no genoma humano, denominados PP1α, PP1β e PP1γ. Maior complexidade advem ainda do ‘splicing’ alternativo que é conhecido para a PP1α e PP1γ. O gene da PP1γ origina uma variante ubíqua, a PP1γ1, e uma variante enriquecida em testículo, a PP1γ2, que é também a isoforma da PP1 mais abundante em espermatozóides, e que pode ser alvo de uma terapêutica para a infertilidade masculina ou contracepção. Rastreios de uma biblioteca de cDNA de testículo humano utilizando o sistema dois-híbrido de levedura foram realizados usando como iscos a PP1γ1 ou a PP1γ2. Várias novas proteínas que se ligam à PP1 foram identificadas e as respectivas interacções validadas usando uma diversidade de métodos, quer in vivo quer in vitro (utilizando PP1γ1 e PP1γ2 recombinantes produzidas em sistemas de expressão bacterianos). Nas condições testadas, ambas as variantes recombinantes da PP1γ apresentaram propriedades enzimáticas semelhantes, o que confirma que a sua especificidade funcional é provavelmente adquirida pela ligação de proteínas reguladoras. Neste trabalho iremos focar em duas proteínas que ligam a PP1 e que foram recentemente identificadas no laboratório, denominadas I2L e Nek2C. A I2L (Inhibitor 2-like) é >90% idêntica ao I2, tanto ao nível nucleotídico como ao nível da sequência de amino ácidos, e constitui uma isoforma nova do I2. Previamente tinha sido identificada como um pseudogene, no entanto apresentamos evidências que apoiam a sua expressão no testículo. A ausência da Thr-73 da I2L é muito significativa e pode ter consequências fisiológicas importantes. Esta ausência resulta numa inibição permanente da actividade da PP1γ2 pela I2L, promovendo potencialmente o desenvolvimento unidireccional da motilidade à medida que os espermtozóides viajam através do epidídimo. A Nek2C é uma nova variante de ‘splicing’ da Nek2A, diferenciando-se apenas pela ausência de 8 aminoácidos Nterminais à sequência consenso de ligação à PP1. Contudo a falta destes 8 aminoácidos tem consequências evidentes, resultando na expressão funcional de um NLS (sinal de localização nuclear). Deste modo, o mecanismo de ‘splice’ alternativo controla a translocação nuclear desta proteína cinase reguladora do ciclo celular, fornecendo um mecanismo pouco usual de modulação da localização da Nek2 e permitindo que a cinase desempenhe funções tanto nucleares como citoplamáticas. A PP1 encontra-se também em ambos os locais, regulando uma enorme variedade de processos celulares. No futuro espera-se que o presente trabalho possa contribuir para uma melhor compreensão dos eventos moleculares envolvidos no controlo da motilidade dos espermatozóides e na fertilização. Estas proteínas que interagem com a PP1 podem constituir alvos para interferir com diferentes funções específicas da PP1. Tanto a I2L como a Nek2C exibem características únicas, podendo constituir candidatos interessantes para futuros desenvolvimento no âmbito do diagnóstico e terapêutica baseadas na transdução de sinais para a contracepção e para o tratamento da infertilidade masculina.

Male infertility is a problem of growing concern in our society. Various factors contribute to this condition including motility defects in sperm. The molecular basis of sperm motility has not been fully elucidated, but non-motile immature sperm acquire motility when incubated with protein phosphatase inhibitors. Thus, protein phosphorylation is a key regulatory mechanism in sperm motility. In eukaryotic cells protein phosphorylation is a major general mechanism regulating signal transduction cascades. Consequently, protein kinases and protein phosphatases are central players in these reversible and dynamic processes. Among them, the serine/threonine-specific protein phosphatase 1 (PP1) appears to play a particularly important role in the control of sperm motility and in the testsis. In somatic cells, PP1 is known to be involved in many diverse processes, including cell cycle control, muscle contraction, gene expression, neuronal activity and glycogen metabolism. Functional specificity is provided by PP1 catalytic subunit interacting proteins, which bind the catalytic subunit and target it to a specific substrate or subcellular location, and/or modify its activity towards those substrates. To date more than 50 unrelated and biochemically diverse regulatory subunits have been described. PP1 diversity can also arise from the expression of various isoforms: three PP1 genes occur in the human genome, termed PP1α, PP1β and PP1γ. Further complexity derives from alternative splicing events, known to occur at least for PP1α and PP1γ. The PP1γ gene produces a ubiquitously expressed PP1γ1 variant and the alternatively spliced PP1γ2 variant that is highly enriched in testis and is the main PP1 protein found in mammalian sperm. Therefore, it is the latter which has been implicated in the control of sperm motility. Hence, in this work we set out to identify and characterize PP1γ2 interactors expressed in human sperm, which could be targeted for male infertility therapeutics and contraception. Yeast two-hybrid screens of a human testis cDNA library were carried out using either PP1γ1 or PP1γ2 as bait. Several novel PP1 binding proteins were identified and interactions were validated using a variety of methods, both in vivo and in vitro (using purified recombinant PP1γ1 and PP1γ2 expressed in a bacterial expression system). Both recombinant PP1γ variants exhibited similar Enzymatic profiles under the conditions tested, thus confirming that functional specificity is likely acquired by the binding of regulatory proteins. Here, we will address two recently identified novel PP1 binding proteins, namely I2L and Nek2C. I2L (Inhibitor 2-Like) is >90% identical to I2, both at the nucleotide and amino acid levels, and constitutes a novel I2 isoform. Previously identified as a pseudogene, we present evidence supporting its testisspecific expression. The lack of Thr-73 from I2L is highly significant and may have important physiological consequences. The missing Thr- 73 results in I2L being able to permanently inhibit PP1γ2 activity and potentially promote the unidirectional development of motility as sperm travel through the epidydimis. Nek2C is a novel splice variant of Nek2A, differing solely from the latter in missing 8 amino acids immediately N-terminal to the consensus PP1 binding motif. However, the lack of those 8 amino acids also appears to have marked consequences, resulting in the expression of a functional NLS (nuclear localization signal). Thus, alternative splicing controls nuclear translocation of this cell cycle regulated protein kinase, providing an unusual mechanism for modulating Nek2 localization and enabling it to undertake both nuclear and cytoplasmic functions. PP1 is known to occur in both locations, where it regulates many different cellular processes. In the future, it is hoped that the present work may contribute to a better understanding of the molecular events underlying sperm motility and fertilization. Clearly, such PP1 interacting proteins may provide interesting targets to interfere with specific PP1 functions. Thus, since both I2L and Nek2C exhibit unique characteristics, they may constitute interesting candidates for future developments in signal transduction diagnostics and therapeutics for contraception and the treatment of male infertility.