Ensaio de hibridação em sanduíche na deteção de fungos

Abstract

A deteção precoce de contaminantes microbianos é essencial para evitar sua disseminação, no entanto a maioria das análises clássicas são lentas, inespecíficas, e limitadas a microrganismos cultiváveis. Tendo em conta estas dificuldades, têm sido desenvolvidas diversas técnicas para quantificar comunidades microbianas em um menor espaço de tempo. Métodos moleculares são os mais indicados, porém não são totalmente aceites para uso rotineiro por necessitarem de reagentes e equipamentos dispendiosos e profissionais experientes. Assim, o ensaio de hibridação em sanduíche para uma quantificação rápida, simples e barata de fungos foi avaliado. O objetivo foi otimizar as condições deste método visando obter uma resposta mais sensível a já descrita anteriormente para este grupo de organismos. Neste método duas sondas hibridam com o RNA alvo e os sanduíches formandos produzem um sinal fluorescente quantificável. Isto ocorre porque a sonda de captura imobiliza somente o RNA hibridado, desta maneira é feita a lavagem das sondas restantes e dos RNA não-alvo. Só então é adicionado o substrato que reagirá enzimaticamente com o complexo enzimaanticorpo- DIG ligado à sonda de deteção, desta maneira o sinal produzido será equivalente à quantidade de RNA alvo da amostra em questão. A levedura Saccharomyces cerevisiae foi selecionada como alvo para este estudo por ter suas características bastante conhecidas e ser um ótimo organismo modelo para eucariotos. Diversas concentrações de células foram utilizadas nos ensaios onde o limite de deteção foi de 104 células/ml.

Early detection of contaminants is essential to prevent it’s spread, but most analyzes are still slow, nonspecific, and limited to cultivable microorganisms. Given these difficulties, several techniques have been developed to quantify microbial communities in a shorter time. Molecular methods are suited, but not fully accepted for routine use because it requires expensive reagents and equipment and experienced professionals. Thus, the sandwich hybridization assay for quick, simple and inexpensive fungi quantifying was evaluated. The objective was to optimize this method to obtain a more sensitive signal to previously described for this group of organisms. In this method two probes hybridize to the target RNA and the sandwiches produced a measurable fluorescent signal. This is because the capture probe immobilizes only the hybridized RNA, in this manner the probes and the others non-target RNA are washed. Then is added the substrate which will react with the enzyme-linked with the DIG detection probe, the signal produced in this way is equivalent the amount of target RNA in the sample in question. The yeast Saccharomyces cerevisiae was selected as a target for this study by having their features well known and be an excellent model organism for eukaryotes. Various cell concentrations were used in tests where the detection limit was 104 cells/ml.