O papel da glutationa na tolerância ao cádmio em Rhizobium leguminosarum

Abstract

O crescente aumento de metais pesados no solo, devido a poluiçâo ambiental, afecta directamente a comunidade microbiana bem como as relações simbióticas que alguns destes microrganismos estabelecem com leguminosas. Uma dos metais pesados mais prejudiciais e tóxicos é o cádmio. Devido à sua elevada toxicidade, este metal constitui uma grave ameaça, não só para as comunidades bacterianas presentes nos solos, mas também para os outros organismos, uma vez que a transferência de iões metálicos ao longo da cadeia alimentar e uma realidade e um problema sério de saúde pública. Sendo a glutationa um importante agente antioxidante e quelante de metais, este trabalho foi delineado de modo a perceber qual o papel deste tripéptido na tolerância ao cádmio em Rhizobium leguminosarum. Inicialmente alguns isolados de R. leguminosarum foram expostos a diferentes concentrações de cádmio e foi testada a influência da glutationa no seu crescimento. Dos isolados que apresentaram um aumento significativo de tolerância na presença desse tio1 (4 em 5), foram seleccionados dois com graus de tolerância distintos, E20-8 (tolerante) e NI-2 (sensível), para a realizaçâo do restante trabalho experimental. Posteriormente foi avaliado o nivel de stresse oxidativo dos dois isolados, através da determinação dos níveis de GSH e de GSSG intracelulares e das actividades de algumas das principais enzimas envolvidas no stresse oxidativo (SOD, CAT, GR e GPX). Os resultados demonstraram que a exposição ao cádmio induziu stresse oxidativo nas células, o que foi comprovado pelo aumento na concentração de GSSG e pela indução de actividade das enzimas estudadas. A adição de glutationa ao meio de crescimento teve um efeito protector, principalmente no isolado sensível. Os dados obtidos sugerem que o aumento de tolerância ao cádmio em R. leguminosarum não está relacionado com uma maior eficiência do mecanismo antioxidante per si, mas com níveis mais elevados de glutationa intracelular. Mostrou-se ainda que o fornecimento de glutationa ao isolado sensível aumentou a sua tolerância. Tendo já sido demonstrado que a capacidade de aumentar a síntese de glutationa estava relacionada com uma maior tolerância ao cádmio. Assim é plausível concluir que a glutationa desempenhe um papel fundamental na tolerância ao cádmio nesta espécie e que esse papel não se limite á sua actividade como antioxidante. Assim, foi estudado o papel da glutationa como agente quelante nesta espécie e, através da adaptação de um protocolo inicialmente desenvolvido para complexos de fitoquelatinas. As diferentes fracções de cádmio extraídas foram separadas: o cádmio fracamente ligado a parede foi removido por extracção aquosa em banho de ultrasons. O cádmio intracelular foi obtido por extracções sequenciais com tampão HEPES, de modo a manter a estabilidade de possíveis complexos. O cádmio ligado á membrana e a parede celular foi extraído com ácido. O cádmio intracelular foi separado por cromatografia de exclusão molecular e as fracções correspondentes aos picos de cadmio foram colhidas e analisadas por HPLC. Verificou-se que a percentagem de cadmio retido na parede celular era semelhante nos dois isolados, demonstrando a importância deste mecanismo, mas confirmando contudo que esta não pode justificar a diferença de tolerância entre os isolados. O isolado tolerante apresentou uma maior concentração de cadmio intracelular. A análise por HPLC revelou que a glutationa era o principal agente quelante de cádmio em Rhizobium, sendo responsável pela complexação de 75% do cádmio intracelular no isolado tolerante e por 28% no isolado sensivel. A adição de glutationa ao meio de crescimento aumentou a eficácia da complexação de cádmio, passando para 90% no isolado tolerante e para 53% no sensível. Os dados apresentados nesta tese contribuem certamente para a compreensão da tolerância aos metais pesados em bactérias. No entanto, os resultados deste trabalho não se cifram só em respostas, mas também em questões. A razão pela qual a adição de glutationa diminui o cádmio intracelular na estirpe tolerante e qual o destino dos complexos nas células são alguns dos pontos que terão de ser esclarecidos em trabalhos futuros.

The increase in the anthropogenic activities has introduced new types of stresses to soil bacteria communities as well as to symbiotic associations between microbes and legumes. Heavy metal contamination, particularly by cadmium, constitutes a problem. Because of its high toxicity, even at low concentrations, cadmium imposes a serious threat to organisms and food-chain transfer of metal ions has become a major public concern. Since glutathione is an important antioxidant and rnetal chelator. this study was undertaken to determine the role of this tripeptide in cadmium tolerance of Rhizobiurn legurninosarurn. Two strains expressing different degrees of tolerance to cadmium stress were used and the influente of the addition of extracelular GSH to the growth media was determined. Oxidative stress and ROS scavenging enzymes were evaluated, as well as changes in GSH and GSSG levels. Results confirmed that cadmium imposes oxidative stress in Rhizobiurn legurninosarurn, which was characterized by an increase in GSSG formation and an induction of SOD, GPX. GR and CAT activities. Addition of reduced glutathione to the growth media had a protective effect, particularly in the sensitive strain. These findings show that increased tolerance in Rhizobiurn legurninosarum is not related to a higher efficiency of the oxygen scavengers per se, but with higher levels of intracellular glutathione. Furthermore, we demonstrated that glutathione suply to the sensitive strain enhanced tolerance, concluding that glutathione plays a crucial role in cadmium tolerance in this species. In a previous report, it was demonstrated that glutathione played an important role in cadmium detoxification in Rhizobiurn cells. but the molecular role of this tripeptide remained to be elucidated. In this work, we report an efficient extraction of GSH-Cd complexes in two R. legurninosarum strains with different levels of tolerance to cadmium. through a modified protocol, originally developed for metal-phytochelatins complexes. The different sub-cellular Cadmium fractions were extracted: loosely bound cadmium was extracted with water, in an ultrasonic bath; intracellular cadmium was sequentially extracted with HEPES buffer; and wall-bound cadmium was extracted with acid. Intracellular cadmium was separated through size exclusion chromatography, and the amount of cadmium in collected fractions was analysed. Peptide peaks containing the higher cadmium concentrations were analysed by HPLC. In both strains, the same percentage of cadmium was retained in cell walls, hence demonstrating an effective avoidance mechanism, but that was not responsible for the obse~edto lerance differences, displayed by the two strains. Intracellular cadmium accumulation was higher in the tolerant strain and rnetal ions were mainly chelated by small-weight peptides. HPLC analysis revealed that glutathione was the main cadmium chelator in Rhizobirim. being responsible for sequestering 75% of intracellular cadmium in the tolerant strain. The sensitive strain presented a less effective cadmium complexation; only 28% of intracellular cadmium was sequestered by glutathione The presence of glutathione increased the efficiency of this mechanism: the tolerant strain was able to sequester 90% of the intracellular cadmium and the sensitive strain complexed 53%. Our findings add a novel and important aspect to the proposed role of glutathione in heavy metal coping for bacteria. These results can be useful in developing biotechnological strategies for cadmium bioremediation procedures and open novel perspectives for the irnprovement of metal tolerance in soil bacteria. However these findings have raised severa1 questions. The reason why glutathione supply decreases the intracellular cadmium in the tolerant strain and the fate of the complexes within the cell are some of the issues that remain to be elucidated.