Screening of class 1 integrons in clinical isolates of Gram-negative bacteria

Abstract

Actualmente, é cada vez mais frequente a associação de bactérias oportunistas e comensais resistentes a antibióticos com infecções nosocomiais. Este problema clínico tornou-se preocupante e deve-se ao uso indiscriminado de antibióticos. Perante esta pressão selectiva, as bactérias desenvolvem diferentes mecanismos de resistência a estes compostos. A presença de estruturas capazes de transportar genes de resistência, designadas por integrões, que contribuem para a disseminação destes genes bem como a sua associação com o perfil de resistência de bactérias constitui o objectivo do presente trabalho. Assim, foram recolhidas amostras de superfícies das instalações sanitárias, do serviço de Medicina II, do Hospital Infante D. Pedro, Aveiro. Após o isolamento das bactérias em meio selectivo para Gramnegativas (MacKonkey), todos os isolados foram sujeitos a tipagem molecular por BOX-PCR. O perfil de bandas obtido após electroforese foi analisado com o programa GelCompar II software (Applied Maths, Kortrijk, Belgium), permitindo distinguir diferentes grupos clonais. De cada grupo clonal foi seleccionado um isolado para os estudos posteriores, resultando num total de 45 isolados distintos. A pesquisa de integrões classe 1 iniciou-se por um “screening” para o gene da integrase. Nos 25 isolados positivos para este gene, foi amplificada e caracterizada a respectiva região variável. A sequência nucleotídica dos amplicões foi comparada com outras depositadas na base de dados. Os resultados mostraram a presença de integrões em diferentes espécies (Pseudomonas putida, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas mendocina, Proteus mirabillis e Morganella morganii). As regiões variáveis apresentavam diferentes tamanhos e diferentes arranjos de genes. Em geral, predominam gene cassettes que conferem resistência aos aminoglicosídeos, trimetoprime e metalo-β- lactamases. A localização destas estruturas no genoma bacteriano foi efectuada por “southern blot”; o DNA genómico foi digerido com a enzima S1, e sujeito a hibridação com sondas para os genes 16S e da integrase revelando que a maioria dos integrões estão localizados em plasmídeos. Como conclusão geral, verifica-se a prevalência de isolados contendo determinantes genéticos de resistência em superfícies inanimadas do ambiente hospitalar (53.33%), os quais podem constituir um potencial risco para os pacientes, uma vez que se trata de bactérias oportunistas. O facto de estes genes de resistência estarem associados a elementos genéticos móveis, nomeadamente transposões e muitas vezes plasmídeos, facilita a sua disseminação no ambiente hospitalar, principalmente por transferência horizontal de genes.

Currently, it is becoming frequent the association of antibiotic resistant opportunistic and commensal bacteria with nosocomial infections. This is a clinical problem of concern and is based on the indiscriminate use of antibiotics. Given the selective pressure within the hospital environment, bacteria develop different resistance mechanisms to these compounds. The presence of structures, referred as integrons, that carry and disseminate these resistance genes among bacteria and their association with the bacteria resistance profile constitutes the aim of the present study. To this end we collected samples from surfaces of sanitary facilities, of the Medicine II service of the Hospital Infante D. Pedro, Aveiro. After bacteria isolation on a selective medium (MacKonkey) for Gram negatives, all the isolates were molecular typed by BOX-PCR. After electrophoresis, the banding pattern was analysed with the GelCompar II software (Applied Maths, Kortrijk, Belgium), which allowed for the selection of different clonal groups. One isolate was selected from each group for further studies. Forty five isolates were selected for the screening of class 1 integrons. In the twenty-five positive isolates respective variable region was amplified and characterized. Amplicons nucleotide sequences were compared with others deposited in databases. The results revealed the presence of integrons in different species (Pseudomonas putida, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas mendocina, Proteus mirabillis e Morganella morganii). Different lenghts of variable regions and different genes arrays were found. Generally gene cassettes conferring resistance to aminoglycosides trimethoprim and metallo-β-lactamases were predominante. Southern hybridization of S1 digested genomic DNA with 16 rDNA and integrase genes labeled probes revealed that the majority of the integrons are located in plasmids. To conclude, is important to refer that there is a prevalence of opportunistic bacteria possessing integrons in inanimate surfaces within the hospital environment, which can constitute risk to the debilitated patients. Moreover, these structures are associated with mobile genetic elements, mainly transposons and many times plasmids, which facilitates the dissemination of these antibiotic resistance genes in the hospital environment, mainly by horizontal gene transfer.