Perfil da citologia cervico-vaginal por citometria de fluxo

Abstract

O cancro do colo do útero é uma das neoplasias mais frequentes a nível mundial. A infecção persistente por Vírus do Papiloma Humano (HPV) de alto risco foi demonstrada como o principal factor de risco para o desenvolvimento desta neoplasia maligna. Na luta contra o cancro, em particular o cancro do colo do útero, várias técnicas auxiliares de diagnóstico têm sido propostas para aumentar a precisão do rastreio citológico, nomeadamente a aplicação da citometria de fluxo (FCM). Esta é uma técnica objectiva, rápida e sensível, em que equipamentos mais avançados permitem, também, a separação física de citomas – separador celular activado por fluorescência (FACS). O objectivo geral deste trabalho visou o estudo das potencialidades de FCM na análise de citologia cervico-vaginal (CCV) em meio líquido, dada a pouca informação disponível nesta área. Embora as técnicas de rastreio actualmente utilizadas sejam fiáveis e rápidas, a utilização da FCM pode apresentar-se como uma técnica complementar, com a utilização das suas potencialidades de análise multiparamétrica. Neste estudo preliminar foram analisadas 54 amostras de CCVs fixados em meio líquido PreservCyt (ThinPrep®), divididos em 7 grupos de diagnóstico citológico, segundo classificação de Bethesda 2001: negativo para lesão intraepitelial ou malignidade (“NILM”), “NILM-Atrofia”; “NILM-Inflamação”; células pavimentosas atípicas de significado indeterminado (“ASC-US”); lesão intraepitelial de baixo grau (“LSIL”); lesão intraepitelial de alto grau (“HSIL”) e “Carcinoma epidermóide”. Os casos foram caracterizados, em FCM, relativamente à dispersão frontal e lateral da luz (FS e SS), intensidade de fluorescência com o marcador intercalar de DNA iodeto de propídio (IP), intensidade de marcação para o marcador específico CD45 e, ainda, procedeu-se à separação física de subpopulações por FACS. Nestes resultados preliminares e na abordagem inicial de casos do grupo citológico de “NILM”, detectaram-se duas subpopulações distintas em FS vs SS. Este perfil foi o predominante, contudo, variou em alguns dos grupos citológicos. Por exemplo, nos grupos “NILM-Atrofia” e “Carcinoma epidermóide” verificou-se uma distribuição dos eventos em “arrasto”, não permitindo uma distinção clara de subpopulações. A metodologia aplicada, segundo a sequência de: análise da dispersão da luz, marcação com IP, marcação com CD45 e FACS; mostrou-se até ao momento inconclusiva dado que, no final, as células das duas subpopulações mostraram ser do mesmo tipo celular (células pavimentosas). Por outro lado, embora não se tenha até ao momento estabelecido uma correlação entre as subpopulações obtidas por FCM e os grupos citológicos, o perfil de arrasto descrito pode dar informação sobre um possível diagnóstico citológico de “NILM-Atrofia”. Em função destes resultados inconclusivos e da literatura existente, está em curso um estudo mais alargado em termos de amostragem em meio líquido (e.g. diferentes meios/condições de preservação e diferentes anticorpos), no sentido de compreender os resultados obtidos em FCM e FACS, e explorar esta técnica como auxiliar de diagnóstico no rastreio do cancro do colo do útero.

Cervical cancer is one of the most common cancers worldwide. Persistent high risk human papillomavirus (HPV) infection has been demonstrated as the main cause of cervical cancer. In the fight against cancer, in particular cervical cancer, various auxiliary diagnostic techniques have been proposed to increase the accuracy of cytologic screening, including the application of flow cytometry (FCM). This is an objective, rapid and sensitive technique, which is possible in more advanced equipment, also, the physical separation of cytomas - by fluorescence activated cell corter (FACS). The general aim of this work was to study the potential of FCM analysis of the cervicovaginal cytology (CCV) in liquid-based, given the little information available in this area. Although the screening techniques currently used are reliable and fast, the use of FCM can be presented as a complementary technique, taking advantage of its potential for multiparametric analysis. In this preliminary study were analysed 54 samples of CCVs fixed in a basedliquid PreservCyt (ThinPrep®), divided into 7 groups of cytological diagnosis, according to Bethesda 2001 classification: negative for intraepithelial lesion or malignancy (“NILM”), “NILM-Atrophy”; “NILM-Inflammation”; atypical squamous cells of undetermined significance (“ASC-US”), low-grade squamous intraepithelial lesion (“LSIL”), high-grade squamous intraepithelial lesion (“HSIL”) and “Squamous cell carcinoma”. The cases were characterized, by FCM, for forward and side scatter (FS and SS), fluorescence intensity with the DNA intermediate marker propide iodide (PI) and the leucocyte specific marker CD45, and also proceeded to the physical separation of populations by FACS. In these preliminary results and in the initial approach about cases of the cytological group "NILM", there were two distinct subpopulations in FS vs SS. This profile was predominant, however, varied in some of the cytological groups. For example, in the groups "NILM-Atrophy" and "Squamous cell carcinoma" there was a distribution of events in drag, not allowing a clear distinction of subpopulations. The applied methodology, according to the following: review of light scatter, IP marking, CD45 marking and FACS; proved inconclusive so far because, in the end, the cells of both subpopulations were shown to be of the same cell type (squamous cells). Moreover, although we have not so far established a correlation between subpopulations obtained by FCM and cytological groups, the drag profile described can give information about a possible cytological diagnosis of "NILM-Atrophy”. In light of these inconclusive results and the existing literature, is an ongoing larger study in terms of sampling in based-liquid (e.g. different based-liquids/ conditions of preservation and different antibodies), in order to understand the results obtained in FCM and FACS, and explore this technique as a auxiliar of diagnostic in the screening of cervical cancer.