Modelos de neurodegeneração e stress do retículo endoplasmático em Drosophila

Abstract

As doenças neurodegenerativas caracterizam-se por um aumento de morte celular em populações neuronais específicas, que variam dependendo do tipo de doença. A utilização de modelos animais constitui a forma mais eficaz de estudar, in vivo, a patofisiologia destas doenças. Utilizando Drosophila melanogaster, vulgarmente designada “mosca da fruta”, como organismo modelo, pretendia-se demonstrar a relevância do stress do retículo endoplasmático (RE) e da Unfolded Protein Response (UPR) no processo de neurodegeneração. Para isso, foram estudados os mecanismos de protecção vs morte celular induzidos pela via de sinalização Ire1/Xbp1 e procurou-se identificar alvos genéticos desta via. Neste estudo utilizou-se como ensaio o fenótipo do olho “glossy”, obtido pela sobre-expressão de Xbp1spliced nas células do olho durante os estádios larvares. Através de um screen genético e de análises microarray de DNA em células sobre-expressando Xbp1spliced, foram identificados dois genes candidatos a alvos genéticos da via Ire1/Xbp1: sac1 e ninaA. Demonstrou-se que a forma mutada de sac1, contendo um p-element na região reguladora do gene, provoca um agravamento deste fenótipo, aumentando os níveis de neurodegeneração no olho do adulto. Este resultado constitui uma indicação de que sac1 mutado poderá ser um “enhancer” deste fenótipo. No entanto, as mutações pontuais de sac1, L2F e L16C, não causaram nenhum efeito significativo sobre este fenótipo. Assim, mais estudos são necessários para clarificar o papel de sac1 neste contexto de neurodegeneração. Relativamente a NinaA, uma chaperone da rodopsina-1, demonstrou-se que a expressão de ninaA é afectada pela via Ire1/Xbp1, uma vez, que em células mutantes de Ire1 o nível de expressão deste gene diminuiu drasticamente. Outra finalidade deste trabalho consistia no desenvolvimento de novos modelos das doenças neurodegenerativas de Parkinson (DP) e Huntington (DH) em Drosophila. Recorrendo a técnicas convencionais de clonagem molecular, os cDNAs de proteínas associadas às DP e DH foram clonados em pUAST, um vector de expressão em Drosophila. Procedeu-se à expressão destas proteínas em células S2 de Drosophila, tendo sido demonstranda a formação de agregados de proteínas, típicos destas patologias. Simultaneamente foram geradas linhas transgénicas de Drosophila contendo estes cDNAs e foram mapeados os locais de inserção resultantes do processo de trangénese. Por fim, procedeu-se à expressão dirigida das proteínas de interesse no olho de Drosophila e demontrou-se que a versão mutada da proteína associada à DH, a huntingtina, induz a neurodegeneração da retina.

Neurodegenerative diseases are characterized by an increase in cell death of particular neuronal populations, specific to each illness. The use of animal models constitutes the most powerful research tool to study the pathophysiology of these diseases in vivo. By using Drosophila melanogaster, generally known as the fruit-fly, as a model organism, it was intended to demonstrate the significance of the endoplasmic reticulum stress (RE) and of the Unfolded Protein Response (UPR) in the process of neurodegeneration. In order to achieve it, the mechanisms of protection vs. cell death through induction of the Ire1/Xbp1 signaling pathway were investigated, along with the search for new genetic targets of this pathway. The “glossy” eye phenotype, obtained through the expression of Xbp1spliced in the eye-cells while in larval stage was used as an assay in this work. Two genes were identified as genetic targets of the Ire1/Xbp1 pathway by performing a genetic screen and a DNA microarray analysis: the sac1 and the ninaA genes. It was shown that sac1, a gene coding for a lipid phosphatase, in its mutated form containing a p-element, causes an aggravation of the glossy phenotype, increasing the level of neurodegeneration in the adult fly. Such result indicates that the mutated sac1 might be an “enhancer” of this phenotype. However, this result was not reproduced with the point mutations in sac1, L2F and L16C. Therefore, more studies are required to clarify the role of sac1 in this context of neurodegeneration. Regarding NinaA, a chaperone of rodopsin-1, it was shown that the level of expression of ninaA was affected by the Ire1/Xbp1 pathway, as it was drastically decreased in mutant cells for Ire1 gene. The second aim of this work was to develop new models of neurodegenerative diseases of Parkinson’s (PD) and Huntington’s (HD) in Drosophila. Using conventional molecular cloning techniques, the cDNAs coding for relevant proteins of PD and HD was subcloned to the pUAST plasmid, a Drosophila vector. The expression of these relevant proteins in Drosophila S2 cells was demonstrated to induce the formation of aggregates. Simultaneously, Drosophila transgenic lines carrying the genes of interest were generated and the insertion sites were mapped. Finally, we expressed the proteins of interest specifically in the Drosophila eye and it was demonstrated that the mutant form of the protein associated with HD, huntingtin, induces retinal neurodegeneration.