Study of the effect of titanium oxide glass powder in vitro and in vivo

Abstract

No presente trabalho propõe-se estudar o efeito dos produtos de dissolução de pós de vidro com dióxido de titânio (14.48 mol% TiO2), óxido fosfórico (42.76 mol% P2O5) e óxido de cálcio (42.76 mol% CaO) (extracto). O sistema vítreo testado (14TiO2•43P2O5•43CaO, o qual foi formulado por Silva et al., 2008) é um cerâmico à base de cálcio e fosfato (CPC) e o principal desafio consiste na sua aplicação em reconstrução óssea. CPCs são vantajosos devido à ausência de toxicidade e resposta inflamatória e à capacidade em ligar ao tecido do hospedeiro. A incorporação de TiO2 no vidro aumenta a durabilidade e a estabilidade química do sistema, a qual permanece pouco clara. Outras características importantes são a boa bioactividade in vitro quando imerso em soluções plasmáticas e a nucleação da apatite na superfície do material (Silva et al., 2008). As exposições realizaram-se numa linha de células semelhantes a osteoblastos e resistente (células MG-63) e em embriões de peixe Zebra (Danio rerio) como organismos alvo. Esta abordagem é uma perspectiva inovadora de testes de citotoxicidade usando modelos in vitro e in vivo. Caracterizou-se o extracto (concentração iónica e pH) após a dissolução do pó em PBS (Phosphate Buffered Saline) e em água do peixe Zebra. As diluições de extracto estudadas foram entre 0.1% e 50%. Os testes in vitro consistiram em ensaios de viabilidade e proliferação celular (MTT), morfologia das células e colónias (CLSM) e RT-PCR com primers específicos implicados na remodelação do osso. Os dados de MTT foram analisados através de comparações hierárquicas usando nested ANOVA. Em relação às experiências in vivo foram seleccionados embriões viáveis e foram realizados ensaios de toxicidade durante o desenvolvimento embrionário. Após a exposição, a concentração dos iões foi medida via ICP. Congelaram-se as larvas para testar os biomarcadores (AChE, LDH e GST), para averiguar possíveis efeitos em actividades enzimáticas. Usou-se One-way ANOVA para tratar os dados. O extracto causou um efeito inibitório dependente da concentração na viabilidade/proliferação das células MG-63 expostas a 20%-50% de extracto e é evidente entre os dias 3 e 7. Contudo, as células testadas foram capazes de recuperar. Foi detectado um aumento significativo na taxa de crescimento celular entre os dias 7 e 10. A morfologia celular e a organização do citoesqueleto de F-actina (CLSM) não foram afectadas, apesar de ter ocorrido uma redução no número de células imersas em 50% de extracto. O tempo dos eventos celulares pode ser apropriado para ocorrer a reconstrução do osso. A expressão dos genes ALP e BMP-2 foi estimulada (envolvidos na formação do osso) e M-CSF e RANKL foi down-regulated (relacionados com a digestão do osso). Os estudos in vivo (Teste 2) mostraram que a exposição a 10% e 20% de extracto promoveram stress químico nos organismos peixe Zebra seleccionados, e não usaram a via GST para possível eliminação de tóxicos. Os resultados do teste 1 revelaram efeitos possíveis do extracto como a disfunção no sistema nervoso em todos os tratamentos (AChE), a ocorrência de condição de stress químico para ~2.5% de extracto (LDH) e efeito negativo na actividade da GST para ~10% e 20% de extracto (os organismos seleccionaram outras vias de desintoxicação quando expostos a concentrações maiores de extracto ou este enzima foi desactivado, danificado ou inibido). A interacção entre os iões analisados e os embriões/larvas de peixe Zebra e o seu efeito subsequente podem estar relacionados com a forma química dos produtos libertados do biomaterial teste. Por exemplo, a quantidade de iões Ti, Ca e P foi superior após 168 horas que 336 horas de incubação, sugerindo a precipitação de partículas ou presença noutra forma não detectada pelo ICP. Os modos de acção envolvidos são pouco claros e mais informação é necessária para contar a história deste bioprocesso – reconstrução do osso. O vidro testado parece ser promissor em regeneração óssea.

In the present work it is proposed to study the effect of the dissolution products of powders glass with titanium dioxide (14.48 mol% TiO2), phosphorus oxide (42.76 mol% P2O5) and calcium oxide (42.76 mol% CaO) (extract). The glass system tested (14TiO2•43P2O5•43CaO, which was formulated by Silva et al., 2008) is one Calcium Phosphate Based Ceramic (CPC) and the principal challenge is its application in bone reconstruction. CPCs are advantageous because the absence of toxicity and inflammatory response and the ability to bond to host tissue. The incorporation of TiO2 in glass increases the durability and chemical stability of system, which is unclear. Others important characteristics are its good bioactivity in vitro when immersed into plasmatic solutions and nucleation of apatite on the material surface (Silva et al., 2008). The expositions were realized using an osteoblasts-like resistant cell line (MG-63 cells) and zebrafish (Danio rerio) embryos as target organisms. This approach is an innovative perspective of cytotoxicity tests using in vitro and in vivo models. The extract was characterized (ionic concentration and pH) after dissolution of the powder in PBS (Phosphate buffered Saline) and in Zebrafish water. Dilutions of extract studied were between 0.1% and 50%. In vitro tests consisted of viability and cell proliferation assays (MTT), cells and colonies morphology (CLSM) and RT-PCR with specific primers involved in bone remodeling. MTT data was analyzed with hierarchical comparisons using nested ANOVA. For the in vivo experiments viable embryos were selected and toxicity assays were performed during embryonic development. After exposure, ions concentration was measured by ICP. Larvae were frozen to test biomarkers (AChE, LDH and GST) to investigate possible effects on enzymatic activities. One way-ANOVA was done to treat data. The extract caused a slight dose-dependent inhibitory effect in viability/proliferation of MG-63 cells exposed to 20%-50% of extract and it is evident between 3 and 7 days. However, cells tested were able to recover. It was detected a significant increase in CGR between 7 and 10 days. Cell morphology and the organization of F-actin cytosqueleton (CSLM) weren’t affected, besides there was occurred a reduction in cell number of cells immersed in 50% of extract. The time of cells events can be appropriate for bone reconstruction occur. ALP and BMP-2 genes expression were stimulated (involved in bone formation) and M-CSF and RANKL were down-regulated (related to bone resorption). The in vivo studies (Test 2) showed that the exposition to 10% and 20% of extract promoted chemical stress in Zebrafish organisms selected, and they didn’t use GST pathway for possible toxics elimination. Results of test 1 revealed possible effects of extract like disruption of the nervous system in all treatments (AChE), occurrence of chemical stress condition for ~2.5% of extract (LDH) and negative effect on GST activity for ~10% and 20% of extract (organism selected other pathway of detoxification when exposed to higher concentrations of extract or this enzyme was deactivated, damaged or inhibited). The interaction between ions analyzed and Zebrafish embryos/larvae and its subsequently effect can be related to chemical form of products released from biomaterial tested. For example, the amount of Ti, Ca and P ions was higher at 168 hours of incubation than 336 hours, suggesting precipitation of particles or presence in other form not detected by ICP. The ways of action involved are unclear and more data is required to tell the history of this bioprocess – reconstruction of bone. The glass tested seems to be promissory in bone regeneration..