Culture of human cryopreserved ovarian tissue: effect of activin A and GDF9

Abstract

A crioconservação de tecido ovárico é um dos métodos utilizados para preservar a fertilidade de mulheres em risco de menopausa precoce, devido a tratamentos gonadotóxicos. O tecido ovárico crioconservado contém essencialmente oócitos imaturos, não fecundáveis, sendo por isso necessário induzir a sua maturação. A maturação dos oócitos contidos no tecido ovárico crioconservado pode ser realizada transplantando o tecido (in vivo) ou procedendo à sua cultura (in vitro), tema deste trabalho. Este trabalho foi desenvolvido para avaliar a morfologia e a evolução dos folículos ováricos contidos no tecido, recorrendo a três marcadores de qualidade celular [dois marcadores da apoptose (p53 e Bcl2) e um marcador de proliferação celular (Ki67)], sem matriz de suporte, em três meios de cultura distintos durante 14 dias. Este estudo comparativo foi realizado utilizando um meio de cultura base, também usado como grupo de controlo, ao qual se adicionaram, individualmente, duas proteínas pertencentes à Tranforming Growth Factors superfamily, GDF-9 e Activina A. Neste trabalho, verificou-se uma diminuição da população folicular ao longo da cultura para os três meios utilizados. No entanto, a maior proporção de folículos degenerados foram observados no grupo em cultura com Activina A contrapondo com o grupo em cultura com GDF-9 onde se observou a menor percentagem de folículos degenerados. Nos três meios de cultura utilizados apenas se observaram três tipos de folículos (primordial, early primário e primário). Verificou-se uma marcação positiva para os marcadores p53 e Ki67 em todos os meios e ao longo da cultura. Para o marcador Bcl2 não foi observada nenhuma célula da granulosa marcada positivamente. Com este trabalho verificamos uma melhor taxa de sobrevivência no grupo GDF-9, assim como um maior número de folículos e células da granulosa nos primeiros 10 dias de cultura.

Cryopreservation of ovarian tissue is one approach to preserve fertility of young women who are at risk of premature ovarian failure, due principally to a gonadotoxic treatment. The cryopreserved ovarian tissue has essentially immature oocytes, which need to be maturating for ulterior fertilization. Oocyte maturation can be achieved by transplantation or by maturation in vitro, which was the subject of this work. The present work was developed to evaluate the morphology and evolution of follicles using three markers of cellular quality [two apoptotic markers (p53 and Bcl2) and one proliferating marker (Ki67)] during 14 days of culture for three different culture media, without matrix support. For this comparative study we used a serum free medium (control group) to which we added two proteins from the Transforming Growth Factors superfamily Activin A and GDF-9. A diminution of the follicular population was observed throughout the culture and for all the culture media. However, the higher proportion of degenerating follicles (increasing with the time of culture) were observed at the Activin A group (A) and GDF-9 group (G) representing the lower proportion. For the three culture media only three type of follicles were seen (primordial, early primary and primary). All GCs in the three culture media were negative for Bcl2 immunostaining. . Positive marking were observed for the apoptotic marker (p53) and for the proliferating marker (Ki67) in all culture. This study indicate a better survival in the group cultured with GDF-9, a higher number of follicles and cells of the granulosa in the first 10 days of culture