Co-culture of SSEA4+-hASCs derived osteoblasts and endothelial cells

Abstract

The crosstalk between Osteoblasts and Endothelial cells is bidirectional and occurs at two levels: indirect cell communication and direct cell communication mediated by proteins at gap junctions structures. The in vitro study of these interactions rely on co-culture systems where at least two cell types are cultured at the same time and submitted to the same microenvironment that is expected to mimic the in vivo settings. Human adipose tissue has been recognized as a potential source of stem cells for regenerative medicine, with multilineage differentiation potential. Recently, it was found that a specific subpopulation of adipose stem cells isolated from the Stromal Vascular Fraction of the Adipose Tissue, positive for the pluripotency associated marker SSEA4 – SSEA4+-hASCs – can give rise to both osteoblastic and microvascular endothelial-like cells, enabling the obtention of these two cell types from the same cell source. This thesis reports the establishment of a co-culture model for the simultaneous culture of two cell types – SSEA4+-hASCs preconditioned osteoblasts (SSEA4+-hASCs OBs) and SSEA4+-hASCs derived endothelial cells. The influence of the cell culture media and the proportion of each cell type influenced the osteogenic and angiogenic outcomes from the system. Our results show that EGM OST culture media allowed to the maintenance of the osteogenic and endothelial differentiation potential of this subpopulation. Concerning the osteogenic and angiogenic potential of the co-cultures, it was shown that both were more consistent on the conditions with higher proportion of ECs in the system. In conclusion, the co-culture condition with the cell ratio OBs:ECs of 1:3 in EGM OST revealed the most efficient osteogenic outcome parameters as well as great stability of endothelial phenotype along the culture period. The established co-culture system has a great potential to overcome the vascularization limitations of the current Bone Tissue Engineering strategies.

A comunicação celular entre Osteoblastos (OBs) e Células Endoteliais (ECs) é bidireccional e ocorre a dois níveis: comunicação indirecta e comunicação directa, sendo esta última mediada por proteínas através de “gap junctional communication”. O estudo in vitro dessas interacções é desenvolvido através de sistemas de co-cultura, onde pelo menos dois tipos de células são cultivados simultaneamente e submetidos ao mesmo microambiente, sendo espectável que este mimetize mais especificamente o ambiente encontrado in vivo. O tecido adiposo humano é actualmente reconhecido como uma fonte de células estaminais. Uma subpopulação específica de células estaminais isoladas a partir da Fracção Vascular do Estroma do Tecido Adiposo, positiva para o marcador associado de pluripotência SSEA4 – SSEA4+-hASCs – demonstrou ter capacidade de diferenciação osteogénica e endotelial, possibilitando a obtenção de OBs e ECS a partir da mesma fonte inicial. Esta tese reporta o estabelecimento de um modelo de co-cultura de SSEA4+-hASCs precondicionadas para a linhagem osteogénica (SSEA4+-hASCs OBs) e para células endoteliais derivadas da mesma subpopulação. Foi avaliada a forma como o meio de cultura e as proporções de cada tipo celular influenciam os fenótipos osteogénico e endotelial das células em co-cultura. Os resultados demonstraram que o meio de cultura EGM suplementado com factores de diferenciação osteogénica permitiu a manutenção do potencial de diferenciação da subpopulação SSEA4+-hASCs nas duas linhagens. Adicionalmente, os resultados evidenciam um potencial de mineralização e angiogénico mais consistente nas condições de co-cultura compostas por uma maior proporção de células endoteliais. Em conclusão, a condição de co-cultura com a proporção SSEA4+-hASCs OBs: SSEA4+-hASCs derived ECs de 1:3 em EGM OST revelou melhores resultados no que diz respeito ao fenótipo osteogénico e permitiu uma manutenção consistente da estabilidade fenotípica das células endoteliais. O modelo de co-cultura estabelecido tem grande potencial para permitir ultrapassar a limitação de vascularização apresentadas pelas estratégias actuais de Engenharia de Tecidos de Osso.