Estudo da expressão de ADAMTS-8 em linhas celulares de cancro da mama

Abstract

ADAMTS-8, um membro da família das ADAMTS (Desintegrinas e Metaloproteases com motivos Trombospondina), é conhecido por inibir a proliferação de células endoteliais, suprimir a vascularização induzida pelo FGF-2 e inibir a angiogénese induzida pelo VEGF. Existem evidências que demonstram a sua sub-regulação no cancro, nomeadamente em cancro do pulmão de não pequenas células por hipermetilação do seu promotor e em neoplasias malignas do sistema nervoso central. No cancro da mama, ADAMTS-8 parece estar também sub-regulado, no entanto o seu papel e regulação no desenvolvimento destes tumores continua por esclarecer. De forma a clarificar o papel de ADAMTS-8 no cancro da mama, iniciámos um estudo piloto no qual avaliámos a expressão de ADAMTS-8 num painel de linhas celulares de cancro da mama e o efeito da metilação do DNA nessa expressão. A expressão de ADAMTS-8 foi estudada num conjunto de linhas celulares representativas de diferentes subtipos de cancro da mama (ERpositivas/ PR-positivas e ER-negativas/PR-negativas) e em tecido mamário não neoplásico, pelas técnicas de RT-PCR multiplex e PCR em tempo real quantitativo. Adicionalmente, quatro destas linhas celulares foram tratadas com um agente desmetilante (5-Aza-2’-deoxicitidina) e a expressão de ADAMTS-8 reavaliada. ADAMTS-8 é expresso em níveis mais elevados no tecido mamário normal comparativamente com qualquer uma das linhas celulares de cancro da mama estudadas. Entre as linhas celulares, as células ER-negativas/PRnegativas apresentaram níveis inferiores de expressão, em comparação com as ER-positivas/PR-positivas. Adicionalmente, o tratamento de desmetilação induziu um aumento dos níveis de mRNA de ADAMTS-8 numa das duas linhas celulares ER-negativas/PR-negativas. Na outra linha celular ER-negativa/PRnegativa testada, em que não se observou qualquer alteração da expressão após desmetilação, verificou-se, em estudos prévios de aCGH, a deleção da região cromossómica 11q25 onde ADAMTS-8 está localizado. Assim, pelos resultados obtidos, podemos concluir que ADAMTS-8 é sub-expresso em linhas celulares de cancro da mama, comparativamente com o tecido mamário não neoplásico, sendo estes resultados consistentes com estudos previamente realizados. Adicionalmente, encontramos evidências para uma relação entre ADAMTS-8 e os receptores de estrogénio e progesterona, uma vez que as linhas celulares ER-negativas/PR-negativas mostraram níveis inferiores de expressão de ADAMTS-8; além disso, quando uma linha celular ER-negativa/PR-negativa foi tratada com um agente desmetilante, observou se um aumento estatisticamente significativo da expressão de ADAMTS-8. Este resultado pode ser uma consequência da hipermetilação do promotor de ADAMTS-8 ou, uma vez que não foi observado qualquer efeito nas linhas celulares ER-positivas/PR-positivas, pode reflectir uma acção reguladora da desmetilação de ER e/ou PR na expressão de ADAMTS-8. Estudos subsequentes, usando um painel alargado de linhas celulares de cancro da mama e de carcinomas da mama são necessários para esclarecer esta associação entre ER e/ou PR e ADAMTS-8.

ABSTRACT: ADAMTS-8, a member of the ADAMTS family (A Disintegrins and Metalloproteases with Thrombospondin motifs), is known to inhibit endothelial cell proliferation, to suppress FGF-2-induced vascularisation and to inhibit VEGF-induced angiogenesis. There is evidence for a downregulation of ADAMTS-8 in cancer, namely in non-small-cell lung cancer by promoter hypermethylation and in brain tumours. In breast cancer, ADAMTS-8 seems also to be downregulated but its role and regulation in mammary tumour development is largely unclear. To unravel the role of ADAMTS-8 in breast cancer, we initiated a pilot study where we evaluated ADAMTS-8 expression in a panel of breast cancer cell lines and the effect that DNA methylation might have in its expression. ADAMTS-8 expression was screened in a set of breast cancer cell lines, representing different subtypes of breast tumours (e.g. ER-positive/PRpositive and ER-negative/PR-negative) and in non-neoplastic mammary tissue. Both multiplex RT-PCR and quantitative real time PCR was used to evaluate ADAMTS-8 expression. Additionally, four cell lines were treated with a demethylating agent (5-Aza-2’-deoxicitidine) and the ADAMTS-8 expression reexamined. ADAMTS-8 was found to be expressed in higher levels in normal breast tissue than in any of the cell lines studied. Among the cell lines, ERnegative/ PR-negative cells presented lower levels of expression than ERpositive/ PR-positive. The demethylation treatment induced an increase of ADAMTS-8 mRNA levels in one of the two ER-negative/PR-negative cell lines. In another ER-negative/PR-negative cell line, in which we did not observe any alteration after demethylation, we found that previous studies by aCGH, showed a chromosomal deletion of the 11q25 region where the ADAMTS-8 is located. ADAMTS-8 was found to have its expression downregulated in the breast cancer cell lines in comparison to non-neoplastic mammary tissue, which is consistent with previous studies. Additionally, evidences for a relationship between ADAMTS-8 and estrogen and progesterone receptors were found. First, ER-negative/PR-negative cells also showed lower expression levels of ADAMTS-8. Second, when an ER-negative/PR-negative cell line was treated with a demethylating agent, a strong increase of ADAMTS- 8 expression was observed. This increase may be a consequence of ADAMTS- 8 promoter hypermethylation or, since no effect was observed in the ERpositive/ PR-positive cell lines, it may reflect a regulatory action of ER and/or PR demethylation on ADAMTS-8 expression. Further studies making use of a wider panel of breast cancer cell lines and breast carcinomas are needed to clarify this association between ER and/or PR and ADAMTS-8.