Alterações enzimáticas, celulares e histológicas em peixes expostos in situ ao efluente de uma mina

Abstract

A presença de contaminantes nos meios aquáticos é atribuída a processos naturais, como por exemplo a lixiviação de solos, e a processos artificiais relacionados com os resíduos das actividades antropogénicas. Uma vez inseridos no sistema aquático, os contaminantes distribuem-se pelo material em suspensão, no sedimento, na água superficial e intersticial. A actividade mineira é um exemplo de uma fonte geradora de poluição no ambiente envolvente, sendo a descarga do efluente ácido da mina um dos mais graves problemas diagnosticados. A mina abandonada da Cunha Baixa (Mangualde, distrito de Viseu), pelo seu reconhecido impacto, serviu como objecto de estudo para o presente trabalho. Foram definidos como objectivos centrais (i) avaliar a toxicidade dos efluentes de três lagoas artificiais nas imediações da mina e mecanismos subjacentes em peixes, clarificando a relação entre a contaminação e os efeitos bioquímicos, citogenéticos e histopatológicos, e (ii) averiguar se as respostas ou efeitos biológicos obtidos podem constituir indicadores (biomarcadores) de efeito a contaminantes. O presente trabalho pretendeu desenvolver um ensaio ecotoxicológico in situ em indivíduos de Carassius auratus, alicerçado na quantificação de parâmetros subletais. Foram desenvolvidas câmaras de ensaio adequadas para expor organismos ao efluente das três lagoas artificiais em estudo. Os animais foram expostos (i) ao efluente da lagoa de referência (Ref), (ii) ao efluente ácido da mina (M), que se acumula numa lagoa subterrânea, (iii) e ao efluente da lagoa de tratamento (T), onde se procede à neutralização do supra-mencionado efluente. Os períodos de exposição foram 8, 16, 24 e 48h. Após cada período, os animais foram sacrificados para se proceder à quantificação de vários biomarcadores enzimáticos, de genotoxicidade e histopatológicos. Na primeira parte do trabalho, referente à abordagem de nível bioquímico/metabólico, foram estudadas as respostas de stresse oxidativo e do metabolismo de destoxificação do fígado, a partir da análise das enzimas catalase (CAT) e glutationa-S-transferases (GSTs), respectivamente. No músculo dorsal, a actividade da enzima lactato-desidrogenase (LDH), um biomarcador respiratório, forneceu informações sobre o estado metabólico dos organismos. Foram investigadas, ainda, as respostas de neurotoxicidade, a partir análise da enzima acetilcolinesterase (AChE) no tecido nervoso. Na segunda parte do trabalho foi avaliada, ao nível citogenético, a acção genotóxica da exposição à radioactividade e ao stresse químico, por intermédio do teste da frequência de micronúcleos (MN) e de outras anomalias nucleares eritrocíticas (ENA) no sangue periférico e da observação das alterações histopatológicas ao nível do fígado. Todos os peixes expostos ao efluente M morreram durante as primeiras 8h de exposição. Relativamente à exposição aos efluentes Ref e T, os animais não apresentaram alterações significativas nos parâmetros de stresse oxidativo e de neurotoxicidade. Pelo contrário, os parâmetros associados aos metabolismos de destoxificação e de respiração anaeróbia evidenciaram diferenças significativas pontuais, respectivamente, na actividade das enzimas GSTs e LDH, quando comparados com os mesmos tempos de exposição em ambos os efluentes. Na avaliação da genotoxicidade, os peixes expostos ao efluente Ref apresentaram um ligeiro aumento da frequência de MN, embora não significativo. No teste de ENA, observou-se a indução das anomalias ao longo do tempo, embora não se tenham observado diferenças na sua frequência entre os locais em estudo. Ao nível histopatológico, os peixes expostos aos efluentes Ref e T não expressaram alterações morfológicas significativas ao nível do fígado. A estratégia adoptada, baseada na análise integrada de diferentes indicadores, incluindo os níveis molecular (respostas fisiológicas de stresse, como as alterações enzimáticas), subcelular/celular (lesões genéticas como o aparecimento de micronúcleos), tecidos e órgãos (alterações histopatológicas), aplicados ao ciprinídeo C. auratus, demonstrou a sua aplicabilidade na monitorização ambiental de contaminação por metais e/ou misturas complexas resultantes do extracção de minério.

ABSTRACT: The occurrence of contaminants in the aquatic environment is due to natural processes, such as soil runoff, but it can also be attributed to artificial processes related with anthropogenic activities and their resulting wastes. Once in the aquatic system, the contaminants may be associated to the suspended matter or distributed along the sediment, surface and interstitial waters. In particular, mining activities are one of the sources of environmental pollution in nearby areas, where the release of acidic effluents represents a serious utmost problem. According to this trend, the abandoned uranium mine of Cunha Baixa (Mangualde, Viseu), due to its recognised impacts, was defined as the study area of the present work. Overall, the main goals addressed in this work concerned (i) the toxicity assessment of effluents coming from three artificial lagoons in the vicinity of the mine area and the underlying mechanisms that threat fish species, in order to clarify the relationship between contamination and biochemical, citogenetic and histopathological effects; and (ii) the discussion about the potential use of biological responses or effects as effect indicators (biomarkers) concerning the presence of contaminants. In this way, ecotoxicological in situ assays were performed with Carassius auratus, for subsequent quantification of sublethal endpoints. Thereby, appropriate in situ chambers were developed for the exposure of organisms to the effluent from three artificial lagoons: (i) effluent from the reference lagoon (Ref), (ii) acid mine effluent (M) accumulated in a subterranean lagoon, (iii) effluent from the treated lagoon (T), where the acid effluent was neutralized. The exposure periods were 8, 16, 24 and 48h. After each period, animals were sacrificed for the quantification of several enzymatic, genotoxic and histopathological biomarkers. Along the first working part, which was related to the biochemical/metabolic approach, we analysed responses of oxidative stress and of hepatic detoxification metabolism, through the determination of catalase (CAT) and glutathione-S-transferases (GSTs) activities, respectively. In the dorsal muscle, the activity of lactate dehydrogenase (LDH), a respiratory biomarker, provided information about the organisms´ metabolic state. Moreover, the neurotoxic responses were evaluated through the measurement of acetylcholinesterase (AChE) activity, in the nervous tissue. On the other hand, in the second part of this work, we assessed the genotoxic potential of radioactivity and chemical stresses at a citogenetic level, by performing the tests, in the peripheral blood, of the micronucleus (MN) and other erythrocytic nuclear abnormalities (ENA), and by observing histopathological changes in the liver. The obtained outcome evidenced that all fish exposed to M effluent died during an 8h-period. In which concerns the exposures to Ref and T effluents, the animals did not reveal significant changes on the oxidative stress and neurotoxicity parameters. In contrast, the parameters used for the measurement of detoxification metabolism (GSTs activity) and the anaerobic respiration (LDH activity) depicted discrete significant differences, when compared with the same exposure periods, for both effluents. In what concerns the genotoxicity evaluation, fish exposed to the Ref effluent showed a slight, though not significant, increase in the MN frequency. The test of ENA revealed an enhancement of those abnormalities along with an increase of exposure periods, albeit no differences were observed in their frequency between the study sites. The liver of fish exposed in both ponds did not reveal significant histopathological changes in their structure. The adopted strategy, based on an integrated analysis of different indicators at a molecular (physiological responses of stress, like enzymatic changes), subcelular/cellular (genetic damages, such as the occurrence of micronuclei), and tissue and organs (histopathological alterations) levels, on the cyprinid C. auratus, proved to be an useful tool for monitoring the environmental contamination induced by metals and/or complex mixtures resulting from ore extraction.