Expressão genética de Gase, GSase e GDH em Misgurnus anguillicaudatus

Abstract

Muitos peixes conseguem sobreviver a elevados níveis de amónia ambiental; entre eles está o Misgurnus anguillicaudatus, este peixe tem também a capacidade invulgar de volatilizar a amónia. Uma dos métodos de tolerar níveis elevados de amónia é através da regulação do metabolismo da glutamina. As reacções de catabólise e anabólise deste metabolismo são catalizadas pela glutaminase (Gase), glutamina sintetase (GSase) e glutamato deshidrogenase (GDH) e permitem o consumo ou síntese de amónia. Estas reacções metabólicas poderão estar à volatilização da amónia no intestino do Misgurnus anguillicaudatus. O objectivo deste trabalho consistia em caracterizar a expressão dos três genes e do seu possível envolvimento na tolerância e volatilização da amónia. A expressão genética foi analisada no decurso de duas experiências. Numa primeira vários tecidos (cérebro, guelra, rim, fígado, e três partes do intestino), de animais controlo, seriam analisados de forma a determinar uma linha base da expressão dos genes. Na segunda experiência os níveis de expressão genética, para os três genes, em duas porções do intestino (intestino anterior e posterior), de animais expostos a elevados níveis de amónia ambiental, seriam quantificados ao longo do tempo para poder determinar possíveis alterações na expressão. Adicionalmente conduzir‐se‐ia a análise das sequências genéticas e comparação filogenética das sequências obtidas no decurso do trabalho. Os resultados da sequenciação mostraram elevada identidade entre as sequências do Misgurnus anguillicaudatus e os seus homólogos noutras espécies, mas na maior parte dos casos também havia distanciação evolutiva entre as sequências das espécies. Os resultados da expressão genética nos vários tecidos mostraram níveis significativamente elevados para a expressão da Gase e GSase no cérebro, estando de acordo com a importância destas enzimas na reciclagem do glutamato e na eliminação de amónia neste órgão. A expressão dos genes no intestino em resposta à exposição à amónia ao longo do tempo n mostraram alterações significativas, isto sugere que o metabolismo da glutamina não é importante para o processo de volatilização ou que regulação não se dá ao nível da transcrição.

ABSTRACT: Many fishes are able to cope with high levels of environmental ammonia; among them is the oriental weatherloach (Misgurnus anguillicaudatus), which also has the unusual ability to volatilize ammonia. One proposed method of ammonia tolerance in this species is through the regulation of the glutamine metabolism. Glutaminase (Gase), glutamine synthetase (GSase) and glutamate dehydrogenase (GDH) catalyze reaction in which catabolysis and anabolysis lead to the release or consumption of ammonia, and can possibly be associated with ammonia volatilization in the gut of the weatherloach. This work intended to characterize the expression of these three genes and their possible involvement in ammonia tolerance and ammonia volatilization in the gut of the weatherloach. In order to determine the gene expression levels two experiments were analyzed separately. In one, several tissue samples (brain, gill, liver, kidney and three portions of gut) from control animals would be analyzed in order to determine baseline expression levels of the three genes. In the second experiment gene expression levels for the three genes in two sections of the gut (foregut and hindgut) from animals that had been exposed to high environmental ammonia over time would be analyzed in order to determine possible changes in gene expression. Additionally gene sequence analysis and phylogenic comparison would be carried out on the gene sequences obtained during the work. Sequencing results showed high identity between weatherloach and their homologues in other species for each gene, but in most cases with significant evolutionary branching from other species. The results for gene expression in several tissues showed significantly elevated levels of gene expression for Gase and GSase in the brain, which correlates with the importance of these enzymes in glutamate recycling and ammonia detoxification in this organ. The results for gene expression in gut in response to ammonia exposure over time showed no significant changes suggesting that glutamine metabolism is not important in ammonia volatilization or that regulation is not at the transcriptional level.