Técnicas moleculares na detecção de vírus respiratórios

Abstract

São vários os vírus capazes de causar infecção respiratória, provocando quadros clínicos mais ou menos graves, ainda considerados causa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo. A aplicação de técnicas de biologia molecular ao estudo das infecções respiratórias permitiu, nos últimos anos, identificar novos vírus associados a patologias respiratórias (metapneumovirus humano, bocavirus e coronavirus, entre outros). A detecção através de técnicas mais sensíveis como as técnicas moleculares facilita o diagnóstico precoce tendo como consequência um controlo mais eficaz da infecção, sendo possível providenciar atempadamente medidas de isolamento necessárias, evitando assim possíveis surtos hospitalares. O objectivo deste trabalho foi implementar a detecção molecular de vírus respiratórios no laboratório de Biologia molecular, Serviço de Microbiologia do CHP - Hospital de Santo António, Porto. Para tal, foram usados três kits moleculares disponíveis no mercado e o melhor kit (em temos de custo, rapidez e facilidade de execução técnica) foi implementado na rotina do Laboratório. No estudo inicial para a escolha da metodologia a implementar, foram estudadas 58 amostras (lavado nasofaríngeo) no período compreendido entre Julho de 2009 e Junho de 2010, provenientes maioritariamente de crianças com idade inferior a cinco anos, com quadro de doença respiratória. Os resultados obtidos foram comparados com os resultados de IFI (Biotrin®) efectuado na rotina laboratorial do serviço de Microbiologia. O estudo molecular compreendeu a extracção de ácidos nucleicos, amplificação e detecção de vírus respiratórios por três kits distintos: RV15 ACE Detection, Seegene; Pneumovir - CLART®; Magicplex™ RV Panel Real-Time Test. Após implementação na rotina laboratorial do kit Magicplex™ RV Panel Real-Time Test, foram estudadas 263 amostras, entre Fevereiro e Agosto de 2011 provenientes maioritariamente do Internamento e Urgência de Pediatria. No estudo comparativo, o número de vírus detectados pelas três técnicas foi diferente (RV15 -68; Pneumovir-76; Magicplex – 87), os vírus mais comummente detectado foi o RhV (RV15-n=23, 34 %; Pneumovir - n=21, 28 %; Magicplex - n=29, 33 %) seguido de VSR (RV15-n=19, 28 %; Pneumovir - n=19, 25 %; Magicplex - n=23, 26 %). Nas três técnicas foram identificadas co-detecções (RV15 -17; Pneumovir-19; Magicplex – 21) sendo a detecção dupla mais frequente a associação AdV/RhV (Pneumovir n=5, 38 %; Magicplex n=4, 33 %) e VSR/RhV (RV15 n= 6, 43 %). Após implementação do kit Magicplex™ RV Panel Real-Time Test na rotina, das 263 amostras estudadas, 210 foram positivas e 53 amostras negativas para a detecção de vírus respiratórios. O vírus mais comummente detectado foi o AdV (n=120, 57 %) seguido RhV (n=74, 35 %). Das 90 detecções duplas a mais frequente foi AdV/VSR (n=20, 22 %). O estudo comparativo permitiu avaliar a superior sensibilidade dos métodos moleculares, tendo a escolha recaído sobre o kit Magicplex™ RV Panel Real-Time Test por ser o que apresenta uma melhor relação entre custo/beneficio, bem como por ser o método de mais fácil implementação. Os resultados obtidos após seis meses da implementação na rotina laboratorial, revelaram um número elevado de co-detecções. Há ainda uma grande dificuldade na interpretação clínica destes resultados. A quantificação da carga viral, deverá ser o passo seguinte deste trabalho.

Several viruses are responsible for respiratory infections, with possible severe clinical conditions, considered a cause of morbidity and mortality worldwide. The application of molecular biology techniques to the study of respiratory infections allowed the identification of new viruses associated with respiratory disease (human metapneumovirus, bocavirus and coronavirus, among others). The use of sensitive molecular techniques, allows early diagnosis resulting in more effective infection control, providing timely patient isolation, thus avoid. To evaluate three molecular methods for detection of respiratory viruses. After comparison of different kits, to implement a molecular method suitable for routine laboratory analysis, evaluating cost, speed and ease of technical implementation. For comparison purposes, we studied 58 samples (nasopharyngeal lavage) collected between July 2009 and June 2010, mostly from children under the age of five years, with respiratory disease. Results were compared with IF results (Biotrin ®, Diagnostics Hibrids®) performed in the routine microbiology laboratory. The molecular analysis included nucleic acid extraction, amplification and detection of respiratory viruses by three different kits: RV15 ACE Detection, Seegene; Pneumovir - CLART®;Magicplex™RVPanelReal-TimeTest. After implementation of Magicplex ™ RV Panel Real-Time Test in laboratory routine, 263 samples were studied between February and August 2011, mostly from Pediatric ward and emergency. Results: In the comparative study, the number of viruses detected by the three techniques was different (RV15- 68; Pneumovir-76; Magicplex - 87), the most commonly detected virus was RhV (RV15-n = 23, 34 %; Pneumovir - n = 21, 28 %; Magicplex - n = 29, 33%) followed by VSR (RV15 n = 19, 28%; Pneumovir - n = 19, 25 %; Magicplex - n = 23, 26 %).The three techniques allowed identification of co-detections (RV15- 17; Pneumovir-19; Magicplex - 21) the most common being the association AdV / RhV (Pneumovir n = 5, 38 %; Magicplex n = 4, 33 %) and VSR/RhV(RV15n=6,43%). After implementation of the kit Magicplex ™ RV Panel Real-Time Test, of the 263 samples studied, 210 were positive and 53 negative for the detection of respiratory viruses. The more commonly detected virus was AdV (n = 120, 57 %) followed by RhV (n = 74, 35%). In 90 double detections, the most frequent association was AdV/RSV (n=20,22%). The comparative study demonstrated the superior sensitivity of molecular methods, which lead us to choose the kit Magicplex ™ RV Panel Real-Time Test, since it showed a better cost / benefit ratio, as well as better suitability for laboratory implementation. The results after six months of implementation in the routine laboratory, revealed a high number of co-detections, as well as the difficulty in clinical interpretation of these results. Thus, the implementation of complementary methodologies, as well as quantitation of the viral load, may be the next steps in completing this work.