Contribuição para a caracterização bioquímica da doença Niemann Pick

Abstract

A doença de Niemann-Pick tipos A e B (NPD A/B) é uma patologia metabólica hereditária do catabolismo lisossomal dos esfingolípidos causada por mutações no gene SMPD1 que se encontra localizado no cromossoma humano 11p15.4. Este gene codifica a enzima esfingomielinase ácida que catalisa a hidrólise de esfingomielina em ceramida e fosforilcolina. Na doença NPD A/B, a deficiente actividade da esfingomielinase ácida origina a acumulação de esfingomielina em vários tipos de células. Esta doença pode manifestar-se nos primeiros meses de vida e os sintomas principais incluem hepatoesplenomegalia, evidência de envolvimento intersticial pulmonar, atraso do desenvolvimento psico-motor e envolvimento neurológico. No entanto, existem formas clínicas de início mais tardio, com uma evolução mais lenta e sem envolvimento neurológico. Em termos terapêuticos, a suplementação enzimática tem sido investigada encontrando-se actualmente em fase de ensaio clínico. A identificação bioquímica da doença é efectuada através do estudo do nível de actividade enzimática da esfingomielinase ácida em amostras de leucócitos obtidos de sangue total periférico, ou de fibroblastos de pele cultivados, com o substrato natural marcado radioactivamente ou, mais recentemente, com um substrato artificial marcado com um grupo cromogénico. Apesar de tecnicamente mais simples, menos dispendioso e seguro na detecção de mutações com impacto na função catalítica da enzima, o substrato artificial cromogénico não permite detectar mutações específicas que interfiram com o reconhecimento e/ou associação da enzima com o substrato natural (variante pseudo-normal). Apesar de raras, a presença deste tipo de variantes, em homozigotia ou heterozigotia composta, poderá dificultar seriamente o diagnóstico bioquímico da patologia se este for efectuado com substratos sintéticos. No sentido de contribuir para a melhoria da qualidade do diagnóstico bioquímico da NPD A/B, o presente trabalho tem por objectivo a implementação dum ensaio enzimático da esfingomielinase ácida utilizando um substrato sintético fluorogénico. Os resultados obtidos em amostras de leucócitos, fibroblastos e amniócitos sugerem que a inclusão futura deste ensaio fluorimétrico no painel de testes bioquímicos de rastreio pós-natal e pré-natal de Doenças Lisossomais de Sobrecarga permitirá a identificação e a caracterização molecular de doentes com NPD A/B, incluindo os indivíduos afectados com a variante pseudo-normal e, desse modo, contribuirá para um melhor conhecimento sobre a epidemiologia genética da doença na população portuguesa.

Niemann-Pick disease types A and B (NPD-A/B), is an inherited metabolic disorder of lysosomal sphingolipid catabolism caused by mutations in the gene SMPD1 which is located on human chromosome 11p15.4. This gene encodes the enzyme acid sphingomyelinase that catalyzes the hydrolysis of sphingomyelin to ceramide and phosphorylcholine. In NPD-A/B disease, the deficient activity of acid sphingomyelinase results in the accumulation of sphingomyelin in various cell types. The first disease symptoms may appear early in life and include hepatosplenomegaly, evidence of interstitial lung involvement, delayed psychomotor development and neurologic involvement. However, there are clinical forms of later onset, slower evolution and without neurological involvement. In therapeutic terms, the enzyme supplementation has been investigated and is currently undergoing clinical trial. The biochemical identification of the disease is performed by studying the level of enzymatic activity of acid sphingomyelinase in samples of leukocytes obtained from peripheral whole blood, or cultured skin fibroblasts, with the radiolabeled natural substrate or, more recently, with an artificial substrate labeled with a chromogenic group. Although technically simpler, cheaper and safer for the detection of mutations with impact on the catalytic activity of the enzyme, the artificial chromogenic substrate fails to detect specific mutations that interfere with the recognition and/or association of the enzyme with the natural substrate (pseudo-normal variant). Although rare, the presence of such variants in homozygosity or compound heterozygosity, may seriously hamper the biochemical diagnosis of the condition, when using synthetic substrates. In order to contribute to improving the quality of the biochemical diagnosis of NPD A/B, this work aims at the implementation of an enzymatic assay of acid sphingomyelinase using a synthetic fluorogenic substrate. The results obtained in samples of white blood cells, fibroblasts and amniocytes suggest that the future inclusion of this fluorimetric assay in the panel of biochemical tests for postnatal and prenatal screening of lysosomal storage diseases will allow the identification and molecular characterization of patients with NPD-A/B, including individuals affected with the pseudo-normal variant, and thereby contribute to a better understanding of the genetic epidemiology of the disease in the Portuguese population.