Development of a mammalian cell model to study AIP56

Abstract

Fish photobacteriose is a bacterial systemic and deadly infection with rapid course and very high mortalities, caused by the Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp). Phdp spreads through the bloodstream and secretes the apoptogenic exotoxin AIP56 allowing the pathogen to avoid phagocytosis by inducing the apoptotic death of the host phagocytes. Although AIP56 was found to be a key virulence factor of Phdp and the AIP56-related pathology has been well characterized, the molecular targets of the toxin and the molecular pathways it affects/modulates remain to be disclosed. Recent data revealed that AIP56 is an AB-toxin, possessing an N-terminal metalloprotease domain (A domain) responsible for the catalytic activity of the toxin and a C-terminal domain (B domain) involved in the binding/internalization of the toxin into the cells. The N-terminal domain of AIP56 is homologous to the non-LEE encoded effector C (NleC), a type III secreted effector of enteric pathogenic bacteria that cleaves and inactivates the p65 of NF-kB. However, it remains to be investigated if AIP56 also targets NF-kB p65 and if NF-kB p65 inactivation by AIP56 is linked to the apoptogenic activity of the toxin. So far, AIP56 activity has been being studied using an ex vivo model consisting of freshly isolated sea bass peritoneal leukocytes because although the susceptibility of several mammalian cell lines to AIP56 has been assessed, no apoptosis was observed in any of the cell lines tested. This specificity of the toxin may result from the existence of receptors for AIP56 in phagocytes of susceptible hosts and their absence in mammalian cells and suggests that if AIP56 was able to enter mammalian cells, it would be able to induce apoptosis in those cells. The existence of a mammalian cell model for studying in detail the AIP56 activity would be very advantageous, because there is much more availability of tools to study mammalian cells than sea bass cells. In this work, we tested and optimized different protocols for the intracellular delivery of AIP56 and AIP56-related proteins into HeLa cells. We found that the most efficient methods for intracellular toxin delivery were chemical transfection with toxin-encoding expression vectors and the use of the LF/PA system of Bacillus anthracis. The chemical transfection allows not only to obtain and study transiently transfected cells, but also to develop stable transfected cell lines.

A photobacteriose de peixes é uma infecção sistémica de evolução rápida, causada pela bactéria Gram-negativa Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp), que provoca elevadas mortalidades em várias espécies de peixes marinhos. Nos animais infectados, a Phdp dissemina-se na corrente sanguínea e secreta a AIP56, uma exotoxina apoptogénica que permite ao agente infeccioso escapar à defesa fagocítica do hospedeiro através da indução da morte por apoptose dos fagócitos. Embora tenha sido demonstrado que a AIP56 é um factor-chave da virulência da Phdp e embora a patologia associada à AIP56 esteja bem caracterizada, os alvos moleculares da toxina e as vias moleculares por ela afectadas continuam por desvendar. Dados recentes revelaram que a AIP56 é uma toxina do tipo AB, contendo um domínio N-terminal (domínio A) de metaloprotease responsável pela actividade catalítica e um domínio C-terminal (domínio B) envolvido na ligação e internalização da toxina pelas células. O domínio N-terminal da AIP56 é homólogo ao non-LEE encoded effector C (NleC), um efector presente em várias bactérias patogénicas entéricas e secretado por um sistema de secreção do tipo III. Foi recentemente descrito que o NleC corta e inactiva o p-65 do NF-kB. Contudo, continua por investigar se a AIP56 também tem como alvo o p-65 do NF-kB e se existe uma relação entre um possível corte do p65 e consequente inactivação do NF-kB e a actividade apoptogénica da toxina. Embora se tenha avaliado a susceptibilidade de várias linhas de celulares de mamíferos à AIP56, pelo facto de não se ter observado a ocorrência de apoptose como consequência da exposição à toxina em nenhuma das linhas testadas, até ao momento, a actividade da AIP56 tem vindo a ser estudada usando um modelo ex vivo que consiste em leucócitos peritoneais isolados de robalo. A especificidade observada poderá resultar do facto de os receptores de membrana para a AIP56 existirem nos fagócitos dos hospedeiros susceptíveis e estarem ausentes nas células de mamífero, sugerindo que se a AIP56 entrasse nas células de mamífero, poderia ser capaz de induzir apoptose dessas células. A existência de um modelo celular de mamífero para estudar os detalhes da actividade da AIP56 seria muito vantajosa, pois permitiria utilizar um vasto leque de ferramentas disponíveis comercialmente que não existem ou não podem ser usadas em estudos com células de robalo. Neste trabalho testamos e optimizamos diferentes protocolos para introduzir a AIP56 e proteínas derivadas da AIP56 em células HeLa. Dos resultados obtidos, conclui-se que os métodos mais eficazes para a introdução da toxina foram a transfecção por método químico e a utilização do sistema LF/PA do Bacillus anthracis. A transfecção química permite não só obter e estudar células transfectadas de forma transiente, mas também desenvolver linhas celulares transfectadas estáveis.