Inactivação de endósporos bacterianos com fotossensibilizadores porfirínicos

Abstract

A formação de endósporos é uma estratégia de sobrevivência apresentada por algumas bactérias que envolve a formação de um invólucro com várias camadas muito resistentes a danos provocados pelo calor, radiações e químicos. As bactérias produtoras de endósporos são extremamente resistentes a técnicas de desinfecção solar e fotocatalítica. Os derivados porfirínicos produzem espécies reactivas de oxigénio na presença de luz e oxigénio molecular, o que pode constituir uma abordagem interessante na inactivação dos endósporos bacterianos altamente resistentes. O objectivo deste trabalho foi avaliar o potencial de derivados porfirínicos na fotoinactivação de endósporos produzidos por espécies do género Bacillus e também das células vegetativas correspondentes. Bacillus cereus foi usado como modelo biológico, por ser estruturalmente mais semelhante a B. anthracis, tendo sido também testadas outras espécies do género Bacillus (B. subtilis, B. liqueniformis e B. sphaericus), menos críticas do ponto de vista da biosegurança. Foram utilizados vários derivados porfirínicos diferindo no número de cargas positivas e nos grupos de mesosubstituição. O corante Azul de Toluidina (fenotiazina) foi também testado como fotossensibilizador de referência para endósporos bacterianos. Suspensões puras de endósporos foram irradiadas, após pré-exposição no escuro a concentrações de 0.5-60 μM de fotossensibilizador. A cinética de irradiação foi avaliada a partir da quantificação do teor de UFC em alíquotas recolhidas no início da experiência e durante a irradiação. Em todas as experiências foi incluido um controle claro, irradiado sem fotossensibilizador e um controle escuro, adicionado da concentração máxima de fotossensibilizador, mas resguardado da luz. Os resultados obtidos demonstraram que as porfirinas neutras, monocatiónicas e dicatiónicas são ineficazes na inactivação de endósporos de B. cereus (< 1 unidade logarítmica de redução). O derivado porfirínico mais eficaz na inactivação de endósporos foi a molécula tricatiónica com um grupo meso-pentafluorofenilo (Tri-Py+-Me-PF), tendo sido atingida uma redução de 3.5 unidades logarítmicas (log) na concentração de 0.5 μM de porfirina, após 4 minutos de irradiação (40.7 J/cm2). Com as porfirinas tetracatiónica e tricatiónica com um grupo carboxilo também se observou uma redução da concentração de endósporos viáveis em mais de 3 log. Estes resultados correspondem à mesma ordem de grandeza da inactivação obtida com 60 μM de Azul de Toluidina (TBO). Com endósporos de outras espécies de Bacillus, as porfirinas tri e tetracatiónicas causaram redução inferior a 1 log na concentração de endósporos viáveis. Com condições experimentais semelhantes, os derivados tricatiónicos e tetracatiónicos causaram a redução de 5 a 7 log na concentração de células vegetativas de B. cereus e reduções de 2 a 5 log em B. subtilis, B. liqueniformis e B. sphaericus. Nenhum dos produtos testados apresentou toxicidade na ausência de luz. Os resultados permitem concluir que a modificação estrutural dos fotossensibilizadores porfirínicos melhora significativamente a sua capacidade de fotoinactivação, sendo por isso, compostos promissores para aplicação na desinfecção de tecidos vivos, materiais contaminados e águas residuais.

ABSTRACT: The formation of bacterial endospores is a survival strategy of some bacteria that implies the formation of an involucrum composed by several highly resistant layers that increases their resistance to damage caused by heat, radiation and chemicals. Endospore-producing bacteria are extremely resistant to solar and photocatalytic disinfection techniques. Porphyrin derivatives produce reactive oxygen species in the presence of light and molecular oxygen, and can be regarded as an interesting approach for the inactivation of highly resistant bacterial endospores. This work aims to evaluate the potential of porphyrin derivatives for the photodynamic inactivation (PDI) of endospores and vegetative cells produced by different species of Bacillus. Bacillus cereus was included as a model for B. anthracis and the other species tested were B. subtilis, B. liqueniformis and B. sphaericus. Several porphyrin derivatives, differing in the number of positive charges and in the meso-substituent groups were tested. The phenotiazin dye toluidin blue O was also tested as a reference photosensitizer for bacterial endospores. Pure suspensions of bacterial endospores were irradiated, after pre-incubation in the dark with concentrations of 0.5-60 μM of photosensitizer. The kinetics of irradiation was evaluated by the quantification of CFU in aliquots collected at the beginning of the experiment and during the irradiation. A light-control irrradiated without photosentitizer and a dark control with the maximum concentration of photosensitizer but protected from light, were included in all the experiments. Neutral, monocationic and dicationic porphyrins were relatively ineffective in the inactivation of B. cereus endospores (<1 log unit reduction). The most effective porphyrin derivative for the inactivation of endospores was the tricationic porphyrin with a meso-pentafluorophenyl group. With this photosensitizer, at 0.5 μM, a reduction of 3.5 log units occurs after only 4 minutes of irradiation (40.7 J/cm2). Reductions of more than 3 log units of the concentration of viable endospores were also obtained with the tetracationic porphyrin and the tricationic porphyrin with a carboxyl group. These results correspond to the same order of magnitude of inactivation obtained with 60 μM of toluidin blue O (TBO). With endospores of other Bacillus species, the tri and tetra-cationic porphyrin derivatives caused small reductions (< 1 log) in the concentration of viable endospores. Under identical conditions, tricationic and tetracationic derivatives caused reductions of 5 to 7 log in the concentration of B. cereus vegetative cells and reductions of of 2 to 5 log units in suspensions of B. subtilis, B. liqueniformis e B. sphaericus cells. None of the porphyrin derivatives showed toxicity in the absence of light. The results show that the structural changes in porphyrin derivatives can improve significantly their potential as photosensitizers for the inactivation of bacterial endospores and should be considered as interesting compounds to use in the disinfection of live tissues, contaminated materials and residual waters.