Fish biological alterations induced by the Aveiro Lagoon contaminants

Abstract

The present research work has been focused on the importance and complementarity of field and laboratory in vivo and in vitro studies. Fish are often used as bioindicator organisms in biomonitorization studies because they play a major role in the aquatic food-webs. Thus, two representative species of Aveiro Lagoon ichthyofauna were adopted in the present work: the sea bass (Dicentrarchus labrax L.) and the european eel (Anguilla anguilla L.). The field study (Chapter I) concerned the seasonal genotoxic assessment of a polluted lagoon (Ria de Aveiro), using erythrocytic nuclear abnormalaties (ENAs) of D. labrax specimens, collected at six stations of Aveiro lagoon. ENA results demonstrated the existence of a serious risk to fish populations almost at all the sites (except at GAF in spring, RIO in autumn and LAR in winter). Thus, at all the critical sites (BAR, GAF, RIO, LAR and VAG) identified, the results reflected the presence of genotoxic contaminants in the water. In this context, the ENA assay revealed to be a relatively rapid, easy to perform and sensitive genotoxicity test. The laboratory in vivo and in vitro components of the present Master thesis (Chapters II, III, IV and V) was carried out using A. anguilla L. as a biological model. Anguilla anguilla L. was intraperitoneally injected with β-naphthoflavone, (4mg/kg) which is a synthetic flavonoid compound known as a strong hepatic monooxigenases inducer such as ethoxyresourfin-O-deethylase (EROD). A. anguilla L. hepatic microsomes were then isolated and used in EROD activity in vitro studies. The in vitro effects of (i) PAHs - Naphthalene (Naph) and Phenanthrene (Phe); (ii) Resin acid (RAs) – abietic acid (AA) and its derivatives- Retene (Re) on liver microsomal EROD activity were assessed. A consistent dose dependent liver microsomal EROD activity increase in vitro was demonstrated for both Naph and Phe exposure, confirming their strong liver EROD activity in vitro inducer A. anguilla L. (Chapter II). Since the endocrine system plays a major role in fish stress mechanism, the in vitro effect of a steroid hormone such as cortisol – on liver microsomal EROD activity was also studied, individually and in combination with AA and Re. The cortisol concentration adopted for our studies was 6.9nM, based on previous trials (Chapter III). AA (Chapter IV) and Re (Chapter V) in vitro exposure on hepatic microsome showed a significant inhibition of EROD activity at all the concentrations. In vitro EROD activity inhibition caused by AA was inversely proportional to the increased concentration of AA whereas the inhibition caused by Re was proportional to its increased concentrations. The EROD activity inhibition induced in liver microsome by AA and Re in vitro exposure was significantly decreased by the addition of cortisol, (except at 0.3μM concentration of Re). The cortisol exerted a protective effect in liver EROD activity, since a significant reduction of the inhibitory effects caused by AA and Re, was observed in its presence. The data concerning the assessment of in vitro hepatic EROD activity under the above conditions confirm the importance of PAHs and RAs structure and molar concentration as well as the organism’s physiological conditions such as different hormonal status related with EROD activity in vivo induction i.e. either laboratory or field survey.

ABSTRACT: O trabalho de investigação que se apresenta foi direccionado para a importância da complementaridade dos trabalhos de campo e laboratoriais in vivo e in vitro. Os peixes são frequentemente utilizados como organismos bioindicadores nos estudos de biomonitorização devido ao facto de desempenharem um papel fundamental na cadeia alimentar aquática. Deste modo, no presente trabalho foram seleccionadas duas espécies representativas da ictiofauna da Ria de Aveiro: o robalo (Dicentrarchus labrax L.) e a enguia europeia (Anguilla anguilla L.). O trabalho de campo (Capítulo I) diz respeito ao estudo da variação sazonal da genotoxicidade, numa Ria poluída tal como a Ria de Aveiro, utilizando o estudo da frequência das anomalias nucleares eritrocíticas (ANEs) em especímens de D. labrax, capturados em seis estações da Ria (de Aveiro). Os resultados referentes aos As demonstraram a existência de um sério risco para esta população de peixes, em quase todos os seis locais da Ria, (exceptuando a GAF na primavera, o Rio no outono e o LAR no inverno). Assim, em todos os locais identificados como críticos (BAR, GAF, RIO, LAR and VAG) os resultados reflectem a presença de contaminantes genotóxicos na água. Neste contexto, o método das ANEs revelou ser um ensaio de genotoxicidade relativamente rápido, fácil de realizar e sensível. A componente laboratorial in vivo e in vitro da presente Tese de Mestrado, correspondente aos Capítulos II, III, IV and V, foi executada utilizando A. anguilla L. como um modelo biológico. A. anguilla L. foi injectada intraperitonealmente com β-naftoflavona (BNF) (4mg/kg), um composto flavonóide sintético, conhecido pela sua capacidade como forte indutor das monooxigenases hepáticas tal como a -O-desetilase etoxiresourfina (EROD). Os microsomas hepáticos foram isolados, após 24 horas de exposição da enguia ao BNF, e a sua actividade EROD utilizada nos estudos in vitro. Os efeitos in vitro dos (i) HAPs – Naftaleno (Naph) e Fenantreno (Phe); ácidos resínicos (RAs) – Abietic acid (AA) e seus derivados Reteno (Re) sobre a actividade EROD microsomal hepática foram estudados e analisados. O aumento da actividade da EROD microsomal hepática, após exposição in vitro ao Naph ou Phe, revelou de uma forma consistente ser dependente da respectiva dose, confirmando a sua elevada capacidade de indução da actividade EROD in vitro (Capítulo II). Uma vez que o Sistema endócrino nos peixes desempenha um papel importante nos mecanismo de stress, o efeito in vitro de uma hormona esteróide tal como o cortisol sobre a actividade EROD microsomal hepática foi também estudada, individualmente e em combinação com o AA e o Re. A concentração de cortisol seleccionada foi de 6.9 nM, baseada em experiências realizadas para o efeito (Capítulo III). A exposição in vitro dos microsomas hepáticos ao AA (Capítulo IV) e ao Re (Capítulo V) demonstrou a sua capacidade de inibição da actividade EROD para todas as concentrações estudadas. In vitro, a inibição da actividade EROD induzida pelo AA, é inversamente proporcional ao aumento de concentração do mesmo, enquanto que a inibição provocada pelo Re foi proporcional ao aumento da sua concentração. A exposição prévia dos microsomas hepáticos ao cortisol 6.9 nM diminuiu significativamente a inibição in vitro da actividade EROD induzida em pelo AA e Re, (com excepção da concentração 0.3μM de Re). A exposição prévia ao cortisol exerceu uma acção protectora sobre a actividade EROD dos microsomas hepáticos, uma vez que se observou uma redução significativa dos efeitos inibitórios provocados pelo AA e Re. Os resultados obtidos relativos ao estudo in vitro da actividade EROD nos microsomas hepáticos, sob as condições acima referidas, confirmam a importância da estrutura e concentrações molares dos PAHs e RAs, assim como do estado fisiológico do organismo tal como o estado hormonal relacionado com a indução da actividade EROD in vivo, tanto no campo como no laboratório.