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http://hdl.handle.net/10773/7835
Title: | Polydispersion control in enzymatic polymerization of oligonucleotides |
Other Titles: | Controlo da polidispersividade em reacções de polimerização |
Author: | Cordeiro, Ana Alexandra Barrinha |
Advisor: | Lima, João Carlos Saraiva, Jorge |
Keywords: | Biotecnologia Polimerização Cinética química Dispersão |
Defense Date: | 2011 |
Publisher: | Universidade de Aveiro |
Abstract: | The main goal of this work is the development of a stochastic-based kinetic
model to predict the polydispertion in enzymatic polymerization reactions. The
fact that the polymerization occurs simultaneously in several enzymatic sites
which possess different processivities results in a wide size distribution with
different product sizes. To besto control the observed polydispersion, the
following was considered: the enzyme selected to this study was Terminal
Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) as it does not require a template sequence
to catalyze DNA synthesis; and 4-methylcoumarin derivatives were the selected
molecules to act as caging agents for different nucleotides making them
inaccessible to the enzyme. The nucleotide is then released by light due to the
break of the phosphodiester bond between the two molecules when submitted
to monochromatic radiation. The referred system would bring a unique
possibility of creating oligonucleotides in solution with a desired sequence.
Different reaction stoichiometries were tested by the incorporation of
deoxynucelotides and ribonucleotides into an oligonucleotide initiator, where
distinct incorporation patterns were identified. Irradiation studies and controls for
the incorporation reaction of DEACM-ATP, the cage molecule for ATP, were
successfully performed. A comparison was established between the
mathematic model data obtained through simulation and the experimental data
related to the incorporation experiments where the polydispersion effect was
observed. From this study resulted the observation of distinct incorporation
velocities for each nucleotide. Several hypothesis were put together to justify
why the adenine profile was so different from other nucleotides. The enzymesubstrate
complex stability was considered to be one of the hypotheses. This
fact can be related to the biologic function of TdT due to the presence of a
“lariat-like” loop that is supposed to be related to the correct positioning of the
incoming nucleotides. O principal objectivo deste trabalho é o desenvolvimento de um modelo de cinética estocástica para prever a polidispersividade existente em reacções de polimerização enzimática. O facto de a polimerização ocorrer em paralelo em vários locais enzimáticos que apresentam diferentes processividades resulta na obtenção de uma distribuição de produtos com diversos tamanhos. Para melhor controlar esta polidispersividade foram tomadas as seguintes considerações: a enzima seleccionada para este estudo foi a Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) que catalisa a síntese de DNA na ausência de um molde; e foram utilizados derivados de 4-metilcumarinas como cages de nucleotídeos tornando-os inacessíveis à enzima. Após exposição a radiação monocromática, ocorre uma quebra de ligações fosfodiéster e o nucleotídeo é libertado. O referido sistema traria a possibilidade única de síntese de oligonucleotídeos em solução com sequência definida. Foram testadas diferentes estequiometrias de reacção, através da incorporação de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos na extremidade de um oligonucleotídeo iniciador, sendo identificados padrões de incorporação distintos para cada caso. Estudos de irradiação e controlo da reacção de incorporação com DEACM-ATP, molécula utilizada para bloquear ATP, foram efectuados com sucesso. Foi ainda estabelecida uma comparação entre os dados obtidos por modulação matemática, variando diversos parâmetros, e os vários resultados de incorporação obtidos experimentalmente onde a polidispersividade é observada. Desta, resultou a observação de diferentes velocidades de incorporação para cada nucleotídeo. Diversas hipóteses baseadas na estabilidade do complexo enzima-substrato foram propostas para justificar a observação de que o padrão de incorporação do nucleotídeo de adenina seja tão distinto dos restantes. Este facto pode estar relacionado com a função biológica da TdT devido à presença de um “lariat-like” loop que se pensa estar relacionado com o posicionamento de cada nucleotídeo. |
Description: | Mestrado em Biotecnologia |
URI: | http://hdl.handle.net/10773/7835 |
Appears in Collections: | UA - Dissertações de mestrado DQ - Dissertações de mestrado |
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