Culture-independent methodologies to assess diversity and dynamics of Aeromonas communities

Abstract

As Aeromonas são bactérias autóctones em ambientes aquáticos e constituem um grave problema em sistemas de aquacultura devido à sua capacidade de provocar doença em peixes. Estas bactérias são actualmente consideradas patogéneos emergentes em humanos. Os surtos de doença podem estar associados à introdução de estirpes virulentas que evoluíram a partir de outros nichos ou da aquisição de determinantes de virulência do mesmo nicho, ou ainda como resultado de um desequilíbrio na comunidade local de Aeromonas. Assim, torna-se essencial desenvolver métodos fiáveis e reprodutíveis para seguir rotineiramente a dinâmica de comunidades indígenas de Aeromonas de forma a permitir uma detecção precisa de alterações na sua estrutura, antecipando potenciais riscos. Neste estudo, foram desenhados três conjuntos de primers para amplificar especificamente os genes gyrB, rpoD e sodB de Aeromonas. Métodos de PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) foram desenvolvidos com base nestes primers para obter perfis das comunidades. A especificidade dos primers foi testada utilizando como molde DNA de 27 estirpes de Aeromonas pertencentes a 17 espécies previamente descritas e também de 13 estirpes de 11 espécies não alvo. Simultaneamente a especificidade dos primers foi também avaliada in silico através da pesquisa de homologia com sequências depositadas nas bases de dados. Ambas as metodologias permitiram confirmar a total especificidade dos três conjuntos de primers e apenas para os primers RpoD não foi obtida amplificação de duas estirpes de Aeromonas. Para determinar a consistência da informação filogenética fornecida pelos fragmentos amplificados, árvores filogenéticas construídas com base nas sequências dos genes gyrB, rpoD e sodB de Aeromonas depositadas na base de dados GenBank e com base nas sequências dos fragmentos amplificados foram comparadas. Verificou-se que os fragmentos alvos fornecem informação filogenética consistente. Os conjuntos de primers foram testados em DNA de amostras de água da Ria de Aveiro e os produtos foram separados por DGGE. Para todas as amostras, e com todos os conjuntos de primers, obtiveram-se perfis complexos e muito estáveis ao longo do gradiente de salinidade. Resultados obtidos com as três metodologias indicam uma maior variabilidade sazonal das comunidades de Aeromonas. A clonagem e sequenciação dos fragmentos obtidos a partir das amostras ambientais confirmam a especificidade dos primers e revelam que os filotipos dominantes nestas comunidades apresentam elevada similaridade com estirpes de várias espécies de Aeromonas comuns em ambientes aquáticos como sejam A. alossacarophila, A. veronii e A. sobria. Segundo o nosso conhecimento, este estudo apresenta a primeira tentativa de optimização e validação de métodos independentes do cultivo específicos para Aeromonas. Os sistemas desenvolvidos apresentam várias vantagens e consequentemente constituem valiosas ferramentas para avaliar a diversidade e seguir a dinâmica de comunidades de Aeromonas. A utilização de mais de um conjunto de primers pode ser útil para obter uma representação mais clara e real da comunidade em estudo. Os métodos desenvolvidos poderão ainda ser adaptados de forma a serem aplicados em outro tipo de amostras ambientais o que poderá ser importante devido à ampla distribuição das Aeromonas e às suas capacidades patogénicas.

ABSTRACT: Aeromonas are bacteria autochtonous in aquatic environments, and they constitute a serious problem in aquaculture systems because of their capability to cause disease in fishes. Aeromonads are also nowadays considered as emerging pathogens in humans. Disease outbreaks may be associated with the introduction of virulent Aeromonas strains that evolved in other niches, acquisition of virulence determinants in the same niche, or as a result of disequilibrium in the local Aeromonas community. Thus, it becomes essential the development of reliable and reproducible methods to routinely follow the dynamics of indigenous Aeromonas communities and to allow an accurate detection of alterations in their structure, anticipating potential risks. In this study 3 primer sets were designed to specifically amplify fragments of the genes gyrB, rpoD and sodB from Aeromonas. A PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) method based on such primers was established to obtain community specific profiles. Primers specificity was tested by using as template DNA from 27 Aeromonas strains belonging to 17 previously described species, and also from 13 strains from 11 non-target species. Specificity was also assessed in silico using the BLAST tool, by checking sequence matches against the GenBank database. Results obtained confirmed the specificity of all primer sets and only primer set RpoD failed to amplify from two Aeromonas strains. To determine the phylogenetic information contained in the amplified fragments, gyrB, rpoD and sodB sequences available in the GenBank database from Aeromonas species were downloaded and submitted to phylogenetic analyses. A phylogenetic analysis following the same procedures was performed using the PCR target fragments and trees were compared. The phylogenetic information contained in the target fragments was confirmed to be consistent. Primer sets were tested in total DNA from estuarine water samples. A DGGE assay was optimized to separate the PCR products. Community specific profiles were obtained from each sample, for each primer pair. Profiles were very complex and rather stable along the salinity gradient. Aeromonas communities varied essentially in a seasonal basis. Cloning and sequencing of the fragments obtained from environmental DNA confirmed the specificity of the primers and revealed that the dominant phylotypes affiliated with strains included in species common in aquatic environments such as A. alossacarophila, A. veronii e A. sobria. To our knowledge, this study presents the first attempt to optimize and validate Aeromonas-specific culture-independent methodologies. Results indicate that all the developed systems present several advantages and therefore constitute valuable tools to assess diversity and follow the dynamics of Aeromonas communities. The utilization of more than one set of primers may be useful for providing a more reliable and clear representation of the community. The developed methods may be adapted to apply in other types of samples, which may be important due to the wide distribution of aeromonads in the environment and to their pathogenic properties.