Natural algicides against harmful microalgae: screening the bacillamide potential as a prevention tool for cyanobacteria blooms

Abstract

O desenvolvimento de florescências de microalgas e de cianobactérias em ambientes aquáticos, marinhos e de água doce, pode ter consequências nefastas para os ecossistemas e para a saúde animal e humana. A prevenção e o combate à formação destas florescências envolve frequentemente a aplicação de agentes químicos com propriedades algicidas. Contudo, estes agentes são, na sua generalidade, inespecíficos, actuando não apenas sobre os organismos alvo mas também sobre a restante comunidade fitoplanctónica. A bacillamida é um composto natural recentemente isolado a partir de uma bactéria associada ao declínio de florescências de dinoflagelados marinhos. A sua toxicidade natural contra estas microalgas, associada a um baixo custo de produção em laboratório, apontam para a possível utilização deste composto como agente algicida no combate a proliferações algais nocivas. Neste trabalho avaliou-se o efeito da bacilamida e de um conjunto de compostos análogos no crescimento de diferentes estirpes de cianobactérias e de microalgas em cultura, com o objectivo de testar a aplicabilidade destes compostos na prevenção e no combate ao desenvolvimento de florescências. As culturas, inoculadas em microplacas de 96 pocetos, foram expostas a uma série crescente de concentrações de cada um dos compostos testados e incubadas numa câmara de culturas durante 216h. O crescimento algal foi seguido ao longo do período de incubação através da medição diária da densidade óptica (450nm) nos pocetos. As percentagens de inibição do crescimento foram calculadas a partir das curvas de crescimento obtidas em cada condição e as concentrações inibitórias IC50-216h foram calculadas por regressão das curvas de inibição através de análise de probits. A selectividade na acção tóxica de cada um dos compostos testados para as diferentes espécies foi estimada por comparação das concentrações inibitórias IC50- 216h obtidas nas diferentes culturas. Para além dos efeitos no crescimento, os efeitos na morfologia e ultrastrutura foram analisados por observação das células expostas ao microscópio óptico e ao microscópio electrónico de transmissão. Os resultados obtidos revelaram que as cianobactérias tóxicas Microcystis aeruginosa, Aphanizomenon gracile, Anabaena circinalis e Anabaenopsis circularis são mais susceptíveis à bacilamida do que as algas verdes Ankistrodesmus falcatus e Scenedesmus obliquus. Assim, um tratamento com bacilamida a 80µg.L-1 deverá afectar o crescimento destas cianobactérias sem afectar o desenvolvimento das algas verdes. Resumo Contudo, outras cianobactérias, tais como, Nodularia spumigena, Leptolyngbya sp. e Plankthotrix rubescens, exibiram níveis de tolerâncias à bacilamida semelhantes aos obtidos para a maioria das algas eucarióticas testadas. Resultados semelhantes foram obtidos com a bromobacilamida e a clorobacilamida. A metoxibacilamida, por seu lado, revelou-se particularmente tóxica para as cianobactérias Anabaena e Aphanizomenon (IC50-216h= 42 e 85 µg.L-1, respectivamente) em concentrações que não afectaram o crescimento de nenhuma das restantes culturas testadas. A fluorbacilamida e a iodobacilamida revelaram um espectro de acção tóxica mais amplo contra cianobactérias, afectando o crescimento destes organismos em concentrações mais baixas (IC50-216h = 20-40 µg.L-1) do que os restantes análogos testados. No entanto, a estas concentrações, estas bacilamidas afectaram também a maior parte das algas eucarióticas testadas, revelando-se portanto inespecíficas na sua acção tóxica. De todos os compostos testados, a triptamina (percursor da bacilamida) revelou ser o mais tóxico, afectando o crescimento da maioria das cianobactérias testadas em concentrações muito inferiores (IC50-216h = 1,1-4,1 µL-1) às necessárias para afectar o crescimento das clorófitas (IC50-216h = 6,9-10,2 µL-1). As diatomáceas foram contudo igualmente afectadas pela triptamina (IC50-216h = 0,5-2,5 µL-1) pelo que a sua aplicação em ambientes co-habitados por estes dois tipos de organismos fitoplanctónicos pode resultar em efeitos nocivos para ambos. Por outro lado a cianobactéria Planktothrix rubescens revelou-se bastante mais resistente à triptamina que as restantes cianobactérias testadas. As diferentes sensibilidades exibidas pelas diferentes culturas cianobacterianas a cada um dos compostos testados, demonstram que as bacilamidas e a triptamina não devem ser considerados algicidas de largo espectro contra cianobactérias. Contudo a aplicação de distintas bacilamidas no combate ao desenvolvimento de determinadas espécies cianobacterianas em particular, pode revelar-se eficaz desde que o tipo e concentração de bacilamida aplicada não afectem as restantes microalgas que compõem a comunidade fitoplactónica. A decisão sobre o tipo e quantidade de bacilamida a aplicar na prevenção do desenvolvimento de uma dada fluorescência deve portanto ter em conta não só a espécie cianobacteriana dominante mas também considerar a composição relativa de toda a comunidade fitoplanctónica, de modo a não afectar os organismos benéficos para o equilíbrio e produtividade do ecossistema.

Cyanobacterial blooms are of major concern to environmental and human health as they cause water deteoration and produces neuro and hepatotoxins. Bacillamide, a natural algicide produced by the marine bacteria Bacillus sp., and several newly synthesized analogues and also its precursors, were screened for selective antialgal activity against different cyanobacteria and eukaryotic algae. Its selective natural toxicity towards algal bloom-forming species and its possible low-cost synthetic production in the laboratory makes it one of the most promising compounds to pursue for use as a selective algicide against harmful algal blooms. A rapid 96-well microplate bioassay was used for screening selective antialgal activity of newly synthesized bacillamides and related compounds against different cyanobacterial and microalgal cultures. Aliquots of exponential growing stock cultures were inoculated in triplicate into the microplate wells previously filled with serial dilutions of each compound in the culture medium. The plates were steadily incubated in an algal culture chamber and daily optical measurements were used to estimate cultures growth over a 216h period. Inhibition values (%) were calculated from the estimated growth curves and inhibitory concentrations IC50-216h were obtained from the sigmoidal inhibition curves fitted by probit regression analysis. The effects of bacillamide and tryptamine on cell morphology and ultrastructure were also analysed by light and transmission electron microscopy. Results showed that the toxic cyanobacteria Microcystis aeruginosa, Aphanizomenon gracile, Anabaena circinalis and Anabaenopsis circularis were much more sensitive to bacilamide then the chlorophytes Ankistrodesmus falcatus and Scenedesmus obliquus. However, clear signs of morphological and ultrastructural changes induced by bacillamide could be observed on both cyanobacteria and chlorophytes. Other cyanobacteria, namely the Nostocales Nodularia spumigena and the Oscillatoriales Leptolyngbya sp. and Plankthotrix rubescens, exhibit higher tolerances to bacillamide, similar to the ones shown by different non-toxic algae. Thus, the use of bacillamide to control/remediate cyanobacterial blooms, should take into account the species composition in the phytoplankton community in order to avoid noxious effects on harmless phytoplankton. Among the other derivates tested, Fluor- and Chlorine-bacillamide showed similar results, while Metoxibacillamide seemed much less effective and Iodine-bacillamide strongly affected the growth of all the algae tested with no apparent selectivity. Concerning the bacillamide precursors, tryptamine showed much higher toxicity than bacillamides towards all the test organisms, while the 2-acethyl-1,3- thiazole-4-carboxyic acid had no growth effects on both the cyanobacteria and the microalgae screened.