Fotoinactivação de Escherichia coli e Enterococcus faecalis porfirinas livres e suportadas

Abstract

A terapia fotodinâmica antimicrobiana refere-se à combinação de uma fonte de luz, oxigénio molecular e um fotossensibilizador para inactivar células microbianas. Esta terapia tem sido considerada como uma alternativa aos métodos convencionais de desinfecção da água e recentemente demonstrado eficácia na eliminação de bactérias Gram (+) e Gram (-), usando porfirinas catiónicas como fotossensibilizadores. Tendo em conta que a introdução de resíduos porfirínicos no ambiente não é aceitável, têm sido feitos alguns estudos, com resultados promissores, para avaliar a possibilidade de imobilização dos fotossensibilizadores em matrizes sólidas. Para a monitorização do processo de fotoinactivação tornam-se necessários métodos mais rápidos de detecção microbiológica em detrimento dos métodos convencionais laboriosos de plaqueamento, incubação e contagem de colónias. Foi objectivo deste trabalho estudar o efeito fotodinâmico sobre bactérias fecais, Enterococcus faecalis [Gram (+) e Escherichia coli Gram (-)], usando como fotossensibilizadores porfirinas catiónicas meso-substituídas na forma livre e imobilizadas em suportes sólidos. Foi também objectivo deste trabalho transformar E. coli numa estirpe indicadora bioluminescente para avaliar a eficácia de porfirinas utilizando um método rápido, sensível e rentável. Nos ensaios com porfirinas livres, a suspensões bacterianas de 107 CFU mL-1 foram adicionadas três concentrações de porfirinas: 0.5, 1.0 e 5.0 μM. Nos ensaios com porfirinas suportadas, a suspensões bacterianas de 105 CFU mL-1 foram adicionadas duas concentrações de porfirinas: 20 μM e 200 μM. As amostras foram expostas à luz branca artificial (40 W m-2) durante 270 minutos. Uma estirpe de E. coli foi transformada com os genes luxCDABE da bactéria marinha bioluminescente Vibrio fischeri. A estirpe recombinante resultante foi usada para avaliar, em tempo real, o efeito de três porfirinas catiónicas meso-substituídas na actividade metabólica das bactérias, usando luz branca artificial (40 W m-2) e luz solar PAR ( 620 W m-2). As duas porfirinas tricatiónicas (Tri-Py+-Me-PF e Tri-Py+-Me-CO2Me) foram as mais eficientes sobre as duas estirpes, originando um decréscimo na sobrevivência superior a 99,999% ( 7.0 log) após 270 minutos de irradiação para a concentração de 5 μM. A porfirina tetracatiónica também foi eficiente para ambas as estirpes (decréscimo na sobrevivência de 7 log com 5.0 μM após 270 minutos). As duas porfirinas dicatiónicas e a monocatiónica foram as x | menos eficazes nas duas estirpes. Os híbridos Tri-Py+-Me-PF-CS (fotossensibilizador catiónico imobilizado em material de suporte catiónico) e Tri-Py-Me-PF-CS (fotossensibilizador neutro imobilizado em material de suporte catiónico) foram igualmente eficientes contra as duas estirpes (decréscimo de 5 log com 20 e 200 μM na sobrevivência de E. faecalis após 90 minutos e decréscimo de  5 log de E. coli após 180 minutos de irradiação). Com o híbrido Tri-Py+-Me-PF-NS (fotosensibilizador catiónico imobilizado em material de suporte neutro), praticamente não se verificou redução na viabilidade de E. coli, mesmo com 200 μM, mas E. faecalis foi inactivada após 90 minutos. A fotoinactivação da E. coli bioluminescente foi eficiente (> 4 log de decréscimo da bioluminescência) com as três porfirinas, sendo a porfirina tricatiónica Tri-Py+-Me-PF a mais eficiente. Com a luz solar PAR, o processo de fotoinactivação é mais rápido e mais eficiente do que com a luz artificial, para as três porfirinas. O número de cargas positivas, a distribuição das cargas na estrutura da porfirina e o carácter lipofílico dos grupos meso-substituintes são factores que parecem exercer efeitos diferentes na inactivação das duas estirpes. A carga no fotossensibilizador imobilizado não é um factor essencial à fotoinactivação da célula Gram (-), desde que os grupos amino do material de suporte estejam cationizados. A presença de carga positiva no material de suporte é necessária para conseguir a fotoinactivação de E. coli. O uso de bactérias bioluminescentes permite avaliar de forma simples e rápida a eficiência da actividade anti-metabólica destas porfirinas. As vantagens económicas que a terapia fotodinâmica representa em termos de fonte de luz utilizada, síntese e produção de fotossensibilizadores imobilizados, possibilidade de remoção do meio após fotoinactivação e posterior reutilização, além do decréscimo significativo de sobrevivência observado, demonstram que esta metodologia poderá ser uma opção no processo de desinfecção de águas.

ABSTRACT: Photodynamic antimicrobial therapy means the combination of a light source, molecular oxygen and a photosensitizer to inactivate microbial cells. It has been considered to be a possible alternative to conventional methods of water disinfection and has recently been used to efficiently destroy Gram (+) and Gram (-) bacteria using cationic porphyrins as photosensitizers. Since the environmental contamination with porphyrinic residuals is not acceptable and in a way to overcome this water output contamination issue, some pilot studies have immobilized the photosensitizers on solid matrices, with promising results. To monitor the photoinactivation process, faster methods for microbial detection are required instead of laborious conventional plating, overnight incubation and colony count methods. The aims of this work were to investigate the photodynamic effect on faecal bacteria, the Gram (+) Enterococcus faecalis and the Gram (-) Escherichia coli, using free and immobilized meso-substituted cationic porphyrins as photosensitizers. It was also an aim of this work to transform E. coli into an indicator bioluminescent strain in order to evaluate the efficiency of porphyrins in photoinactivation by a rapid, sensitive and cost-effective bioluminescent method. In the experiments with porphyrins in the free form, bacterial suspensions of 107 CFU mL-1 were added with 0.5, 1.0 and 5.0 μM of porphyrin. In the experiments with immobilized porphyrins, bacterial suspensions of 105 CFU mL-1 were added with 20 μM e 200 μM of porphyrins. The samples were exposed to artificial white light (40 W m-2) for 270 minutes. Then, E. coli cells were cloned with luxCDABE genes from the marine bioluminescent bacterium Vibrio fischeri and the recombinant bioluminescent indicator strain was used to assess, in real time, the effect of three cationic meso-substituted porphyrin derivatives on their metabolic activity, under artificial (40 W m-2) and solar irradiation ( 620 W m-2). The most effective photosensitizers against both tested bacteria were the two tricationic porphyrins (Tri-Py+-Me-PF and Tri-Py+-Me-CO2Me) when a 5.0 μM was used, leading to > 99,999% ( 7.0 log) photoinactivation after 270 minutes of irradiation. The tetracationic porphyrin was also a good PS against both bacteria (7 log drop with 5.0 μM after 270 minutes). Both dicationic and the monocationic were the least effective against the two strains. The Tri-Py+-Me-PF-CS (cationic photosensitizer on cationic material) and Tri-Py-Me-PF-CS (neutral photosensitizer on cationic material) hybrids were almost equally xii | effective for both Gram types (5 log decrease with 20 and 200 μM on E. faecalis after 90 minutes and  5 log decrease on E. coli after 180 minutes of irradiation). With Tri-Py+-Me-PF-NS (cationic photosensitizer on neutral material), almost none reduction on E. coli viability was observed, even with 200 μM. However, E. faecalis was completely inactivated after 90 minutes. The photoinactivation of bioluminescent E. coli was effective (> 4 log bioluminescence decrease) with the three porphyrins used, being the tricationic porphyrin Tri-Py+-Me-PF the most effective. With solar irradiation, the photoinactivation process was faster and more efficient than with artificial light, for the three porphyrins. The number of positive charges, the charge distribution in the porphyrins’ structure, and the lipophilic character of the meso-substituent groups, seem to have different effects on the photoinactivation of both bacteria. The charge in the photosensitizer is not essential to Gram (-) cell photoinactivation, as long as the amino groups of the support material are cationized. The presence of positive charge in the support material is needed to achieve photoinactivation of E. coli. The use of bioluminescent bacteria allows the assessment of the efficiency of anti-metabolic action of these porphyrins. The economical advantages this approach represents in terms of light source used, synthesis and production of the immobilized photosensitizers, possibility of removal after photoinactivation and further reuse, besides the significant photoinactivation observed, makes photodynamic antimicrobial therapy an interesting option to water disinfection.