Toxicity interaction of cooper and salinity on Perez frog life stages

Abstract

Populations of amphibians are declining worldwide. Among the major causes for such decline are chemical contamination and climate changes (e.g. increase in temperature, salinization of coastal freshwater ecosystems). Actually, the group of amphibians may be very sensitive to these stressors as they possess a thin and permeable skin with no physical protection that allows cutaneous respiration but also the diffusion of chemical agents present in the environment. Furthermore, their biphasic life cycle exposes amphibains both to aquatic, terrestrial and atmospheric contamination, potentiating the period of exposure. Consequently, it is necessary to understand the effects that chemical contamination may pose to this group of organisms and how other factors may influence their sensitivity to chemical stress. Accordingly, the present work intended at evaluating how life stage and the combination with other stressors may influence the toxicity of copper to the Perez´s frog Pelophylax perezi (Seoane). To attain this main goal, two specific objectives were delineated: (i) to compare the sensitivity of different life stages, embryos versus tadpoles, to copper (Experimental design 1), and (ii) to evaluate the influence of increased salinity (an indirect effect of climate changes in coastal freshwater lagoons) on the toxicity of copper to embryos and tadpoles of P. perezi (Experimental design 2). For this, eggs at Gosner stage 10-11 and tadpoles at Gosner stage 25 were used to carry out 96h exposure assays. For the first experiment, the two life stages were exposed to a gradient of copper plus a control (FETAX). In the second experiment, embryos and tadpoles were exposed to combinations of copper and NaCl (to simulate an increased salinity) in a complete bifactorial experimental design. In the two experiments the following endpoints were monitored: (i) for embryos, mortality was registered every 24h and at the end of the assay the final body length and malformations rate of surviving larvae were assessed; (ii) for tadpoles mortality and swimming behavior were monitored every 24h. Additionally, at the end of the experimental desing 2 the enzymatic activity, of surviving larvae/tadpoles, was quantified for catalase (CAT), cholinesterase (ChE), glutathione S-transferase (GST) and lactate dehydrogenase (LDH). The obtained results showed that embryos were less sensitive to copper than tadpoles (aproximately 50% of mortality at 1.6 mg/L Cu and LC50=0.93 mg/L Cu, respectively). Furthermore, it was observed that NaCl did not influence the lethal toxicity of copper to tadpoles, but, it significantly reduced the copper toxicity to embryos. Regarding enzymatic responses, a clear and consistent response was not observed for the tested treatments. However, for some copper concentration, the presence of NaCl induced an increase of the activity of CAT, relatively to that observed when orgaisms were exposed solely to copper, both for embryos and tadpoles. Also, in some copper concentrations, the presence of NaCl caused an increase or decrease in the activity of LDH in embryos and tadpoles, respectively. In addition, and contrarirly to what was reported for copper, it was observed that embryos were more sensitive to increased salinity (NaCl) than tadpoles. The results obtained in the present study, highlighted the need, within the context of ecological risk evaluation, to characterize the sensitivity of different life stages of amphibians to different chemicals and to the combination of diverse stressors.

As populacões de anfíbios estão em declínio a nível mundial. Duas das principais causas para este declínio são a contaminação química e alterações climáticas (e.g. aumento das temperaturas, salinização de zonas costeiras). De facto, os anfíbios podem ser muito sensíveis a estes agentes perturbadores, visto possuírem uma pele fina e permeável, sem protecção física, que permite a respiração cutânea mas também a difusão de agentes químicos presentes no ambiente. Além disso, o seu ciclo de vida bifásico expõe-os a contaminação aquática, terrestre, e atmosférica, potenciando o seu período de exposição. Consequentemente, é necessário compreender os efeitos que a contaminação química pode ter neste grupo de organismos, e de que modo outros factores podem influenciar a sua sensibilidade à perturbação química. Deste modo, o presente estudo pretendeu avaliar a influência do estádio de vida e da presença de outros agentes perturbadores na toxicidade de cobre em rã verde, Pelophylax perezi (Seoane). Para atingir este objectivo principal, foram delineados dois objectivos específicos: (i) comparar a sensibilidade de diferentes estádios de vida (embriões verusus girinos) ao cobre (Experiência 1), e (ii) avaliar a influência do aumento de salinidade (efeito indirecto das alterações climáticas em lagoas de água doce costeiras) na toxicidade de cobre para embriões e girinos de P.perezi (Experiência 2). Para tal, foram usados ovos no estádio de Gosner 10-11 e girinos no estádio de Gosner 25 para realizar ensaios de toxicicidade com 96h de exposição. Na primeira experiência, os dois estádios de vida foram expostos a um gradiente de cobre mais um controlo (FETAX). Na segunda experiência, os embriões e girinos foram expostos a combinações de cobre e NaCl (para simular um aumento de salinidade) num desenho experimental bifactorial completo. Nas duas experiências foram monitorizadas as seguintes respostas aos agentes perturbadores: (i) para os embriões, a mortalidade foi registada a cada 24h e no final do ensaio o tamanho corporal final e a taxa de malformações nas larvas sobreviventes; (ii) no caso dos girinos, a mortalidade e o comportamento natatório foram monitorizados a cada 24h. Adicionalmente, no final da segunda experiência (em que foi avaliada a influência de NaCl na toxicidade de cobre), foi quantificada a actividade enzimática da catalase (CAT), colinesterase (ChE), glutationa S-transferase (GST) e lactato desidrogenase (LDH) nas larvas (que eclodiram no final do ensaio-96h) e nos girinos. Os resultados obtidos demonstraram que os embriões foram menos sensíveis ao cobre do que os girinos (cerca de 50% de mortalidade na concentração de 1.6 mg/L Cu e LC50=0.93 mg/L Cu respectivamente). Mais ainda, foi observado que o NaCl não influenciou a toxicidade letal do cobre nos girinos, mas reduziu significativamente a toxicidade do cobre nos embriões. Relativamente às respostas enzimáticas, não foi observado um padrão consistente de repostas aos vários tratamentos. No entanto, em algumas concentrações de cobre, combinadas com NaCl, observou-se que a presença de NaCl induziu a actividade da enzima CAT relativamente ao efeito observado apenas pela presença de cobre. Verificou-se ainda que, em algumas concentrações de cobre, a presença de NaCl induziu uma redução e um aumento da actividade da LDH em girinos e embriões, respectivamente, em comparação com a actividade da enzima em exposições só a cobre. Mais ainda, e contrário ao que foi registado para o cobre, foi observado que os embriões apresentaram uma maior sensibilidade ao aumento da salinidade (NaCl) do que os girinos. Os resultados obtidos no presente estudo destacam a necessidade de, num contexto das avaliações de risco ecológico, caracterizar a sensibilidade dos diferentes estádios de vida dos anfibios a diferentes químicos e a combinações de de agentes perturbadores.