Molecular reconstruction of a genetic code alteration

Abstract

The genetic code establishes the rules that govern gene translation into proteins. It was established more than 3.5 billion years ago and it is one of the most conserved features of life. Despite this, several alterations to the standard genetic code have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes, namely in the fungal CTG clade where a unique seryl transfer RNA (tRNACAG Ser) decodes leucine CUG codons as serine. This tRNACAG Ser appeared 272±25 million years ago through insertion of an adenosine in the middle position of the anticodon of a tRNACGA Ser gene, which changed its anticodon from 5´-CGA-3´ to 5´-CAG-3´. This most dramatic genetic event restructured the proteome of the CTG clade species, but it is not yet clear how and why such deleterious genetic event was selected and became fixed in those fungal genomes. In this study we have attempted to shed new light on the evolution of this fungal genetic code alteration by reconstructing its evolutionary pathway in vivo in the yeast Saccharomyces cerevisiae. For this, we have expressed wild type and mutant versions of the C. albicans tRNACGA Ser gene into S. cerevisiae and evaluated the impact of the mutant tRNACGA Ser on fitness, tRNA stability, translation efficiency and aminoacylation kinetics. Our data demonstrate that these mutants are expressed and misincorporate Ser at CUGs, but their expression is repressed through an unknown molecular mechanism. We further demonstrate, using in vivo forced evolution methodologies, that the tRNACAG Ser can be easily inactivated through natural mutations that prevent its recognition by the seryl-tRNA synthetase. The overall data show that repression of expression of the mistranslating tRNACAG Ser played a critical role on the evolution of CUG reassignment from Leu to Ser. In order to better understand the evolution of natural genetic code alterations, we have also engineered partial reassignment of various codons in yeast. The data confirmed that genetic code ambiguity affects fitness, induces protein aggregation, interferes with the cell cycle and results in nuclear and morphologic alterations, genome instability and gene expression deregulation. Interestingly, it also generates phenotypic variability and phenotypes that confer growth advantages in certain environmental conditions. This study provides strong evidence for direct and critical roles of the environment on the evolution of genetic code alterations.

O código genético regula a correcta descodificação da informação contida nos genes durante a síntese de proteínas. Apresenta um elevado grau de conservação e estima-se que tenha sido originado há mais de 3.5 biliões de anos. Contudo, várias alterações ao código genético foram identificadas em procariotas e eucariotas, nomeadamente nos fungos denominados de “CTG clade”, nos quais um tRNA de serina atípico (tRNACAG Ser) descodifica o codão de leucina CUG como serina. Este tRNACAG Ser foi originado há 272±25 milhões de anos, pela inserção de uma adenosina no centro do anticodão do gene do tRNACGA Ser que alterou a sequência original do anticodão de 5´-CGA-3´ para 5´-CAG-3´. Esta alteração ao código genético promoveu a restruturação do proteoma das espécies denominadas de “CTG clade”. Contudo, permanece por esclarecer o motivo que permitiu que esta alteração atípica fosse preservada no genome destes fungos. Numa tentativa de clarificar os aspectos evolutivos desta alteração ao código genético, procedemos à reconstrução da via evolutiva, proposta para esta alteração, na levedura Saccharomyces cerevisiae. Para tal, induzimos a expressão do gene do tRNACGA Ser de C. albicans, nas versões mutantes e original, em S. cerevisiae e determinámos o impacto das mesmas no crescimento celular, bem como na estabilidade, eficiência na tradução e aminoacilação do tRNA. Os nossos dados, demonstram que as versões mutantes do tRNA, apesar de sua reduzida expressão, induzem a incorporação de serina nos codões CUG de leucina. Observámos ainda, através de uma estratégia de evolução forçada, que o tRNACAG Ser é facilmente inactivado por mutações naturais que impedem o seu reconhecimento pela seryl-tRNA synthetase. O nosso estudo demonstra que a repressão da expressão do tRNACAG Ser, terá desempenhado um papel fundamental na evolução da redefinição do codão CUG de leucina para serina. Com o intuito de compreender a evolução das alterações ao código genético, induzimos redefinições parciais em vários codões de levedura. Os nossos resultados confirmam que a ambiguidade no código genético afecta o crescimento, induz a produção de agregados proteicos, interfere no ciclo celular e promove alterações nucleares, morfológicas, instabilidade genómica e desregulação da expressão genética. Contudo, origina também variedade fenotípica e fenótipos vantajosos em determinadas condições ambientais. Este estudo demonstra o impacto do ambiente na evolução das alterações ao código genético.