Estudos in vitro e in vivo em peixes da Ria de Aveiro

Abstract

Dado a importância e complementaridade existente entre estudos de campo e estudos de laboratório, o presente trabalho engloba ambos os tipos de estudo. Os peixes desempenham um papel ecológico bastante relevante ao nível das cadeias tróficas aquáticas, pelo que são frequentemente usados como organismos sentinela em estudos de biomonitorização. Assim, para o presente trabalho, foram adoptadas duas espécies representativas da ictiofauna da Ria de Aveiro: a tainha garrento (Liza aurata) e a enguia europeia (Anguilla anguilla L.). O estudo de campo consistiu na avaliação genotóxica sazonal de uma laguna poluída (Ria de Aveiro), através da detecção de anomalias nucleares eritrocíticas (ANEs) em espécimes juvenis de L. aurata, colhidos em seis locais da Ria. A investigação revelou um local crítico – Vagos – onde foi possível observar elevadas frequências de ANEs na Primavera, no Verão e no Inverno. Neste contexto, o teste de ANEs revelou ser um teste genotóxico relativamente rápido, fácil de executar e sensível. Para a realização da componente laboratorial e in vitro da presente tese, adoptou-se como modelo biológico A. anguilla L., a qual foi injectada intraperitonealmente com β-naftoflavona (4mg/kg). A β-naftoflavona é um composto flavonóide sintético reconhecido como um forte indutor das monooxigenases hepáticas, como por exemplo a etoxiresorufina O-desetilase (EROD). A EROD tem demonstrado ser muito sensível à indução causada por vários contaminantes, pelo que a sua actividade é frequentemente usada como biomarcador in vivo de exposição a poluentes químicos, nomeadamente hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) e compostos estruturalmente semelhantes. Apesar deste efeito causado, ao nível do fígado, pelos HAPs ou por compostos estruturalmente semelhantes, também pode ocorrer inibição sob diversas circunstâncias, tais como a presença de elevadas concentrações de HAPs ou de outros compostos orgânicos ou de metais pesados. Assim, os microsomas hepáticos foram isolados a partir do fígado de A. anguilla L. e posteriormente usados nos estudos in vitro da actividade EROD efectuados, Os HAPs são compostos toxicologicamente relevantes devido à sua dispersão e persistência nos meios aquáticos, bem como ao seu potencial genotóxico. Assim, procedeu-se ao estudo in vitro dos efeitos de dois HAPs - benzo[a]pireno (B[a]P) e fluoranteno (FL) - sobre a actividade EROD microsomal hepática. Uma vez que o sistema endócrino desempenha um papel extremamente relevante nos mecanismos de stress dos peixes, avaliouse ainda o efeito de duas hormonas esteróides - cortisol (C) e 17β-estradiol (E2) sobre a referida actividade enzimática, isoladamente e em combinação com o B[a]P ou o FL. A concentração adoptada para as duas hormonas esteróides foi de 22.02 nM. O B[a]P revelou ser um forte inibidor in vitro da actividade hepática de EROD. O FL 0.1 e 0.3 M induziu significativamente a actividade EROD microsomal hepática, enquanto que as concentrações mais elevadas (0.9 e 2.7 M) levaram a uma forte inibição desta actividade enzimática, contudo inferior à induzida pelas mesmas concentrações de B[a]P. A exposição dos microsomas hepáticos de A. anguilla L. ao C causou uma indução significativa da actividade EROD hepática. A exposição in vitro ao E2 também levou ao aumento desta actividade enzimática. O C e o E2, exerceram um efeito protector sobre a actividade EROD hepática, uma vez que, na sua presença, verificou-se uma significativa redução dos efeitos inibitórios causados pelo B[a]P e pelo FL 0.9 e 2.7 M. Os resultados da avaliação in vitro da actividade EROD hepática obtidos, sob as condições em cima referidas, confirmam a importância da estrutura dos HAPs e respectiva concentração molar, assim como das condições fisiológicas do indivíduo, como por exemplo diferentes status hormonais para a indução in vivo da actividade EROD, i. e. em estudos de laboratório e em estudos de campo.

ABSTRACT: The present research work has been focused on the importance and complementarity of field and laboratory in vivo and in vitro studies. Fish are often used as sentinel organisms in biomonitorization studies because they play a major ecological role in the aquatic food-webs. Thus, two representative species of the Aveiro Lagoon’s ichthyo fauna were adopted in the present work: the gold grey mullet (Liza aurata) and the european eel (Anguilla anguilla L.). The field study consisted in the seasonal genotoxic assessment of a polluted lagoon (Ria de Aveiro), using erythrocytic nuclear abnormalities (ENAs) of L. aurata juvenile specimens, collected at six stations of Ria de Aveiro. The ENAs survey revealed a critical site – Vagos – where an elevated ENA frequency was observed in Spring, Summer and Winter. In this context, the ENA assay revealed to be a relatively rapid, easy to perform and sensitive genotoxicity test. The laboratorial and in vitro component of the present thesis was carried out using A. anguilla L. as a biological model, which was intraperitoneally injected with β-naphthoflavone (4mg/kg). β-naphthoflavone is a synthetic flavonoid compound known as a strong hepatic monooxigenases inducer such as ethoxyresorufin O-deethylase (EROD). Liver EROD activity induction showed to be very sensitive to several contaminants, thus her activity is often used as an in vivo biomarker of exposure to chemical pollutants, namely polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and structural similar compounds. Despite this effect caused by PAHs or PAH like substances upon the liver, inhibition may also occur under different circumstances such as the presence of high PAH concentrations or other organic compounds or heavy metals. Therefore, A. anguilla L. hepatic microsomes were isolated and then used in EROD in vitro activity studies where those PAHs that are toxicologically relevant due to their dispersion and persistence in the aquatic environments were assayed. Thus, the in vitro effects of two PAHs - benzo[a]pyrene (B[a]P) and fluoranthene (FL) - on liver microsomal EROD activity were assessed. Since the endocrine system plays a major role in fish stress mechanisms, the effect of two steroid hormones such as cortisol (C) and 17β-estradiol (E2) - on liver microsomal EROD activity was also studied, individually and in combination with B[a]P or FL. The same concentration (22.02 nM) was adopted for both steroid hormones. B[a]P revealed to be a strong in vitro inhibitor of liver EROD activity. FL 0.1 e 0.3 M significantly induced liver microsomal EROD activity, whereas the highest concentrations (0.9 e 2.7) M caused a strong inhibition of the mentioned enzymatic activity, though lower than the inhibition induced by the same B[a]P concentrations. A. anguilla L. liver microsomes in vitro exposure to C significantly induced EROD activity. E2 in vitro exposure also caused an elevation of this enzymatic activity. Both C and E2 exerted a protective effect in liver EROD activity, since a significant reduction of the inhibitory effects caused by B[a]P and FL 0.9 e 2.7 M, was observed in their presence. The data concerning the assessment of in vitro hepatic EROD activity under the above conditions confirm the importance of PAHs structure and molar concentration as well as the organism’s physiological conditions such as different hormonal status for EROD activity in vivo induction i.e. either laboratory or field surveys.