Molecular and sub-cellular approaches in soil ecotoxicology

Abstract

O organismo teste Enchytraeus albidus é frequentemente utilizado na avaliação de risco ambiental em solos. Existem testes biológicos padronizados para este organismo (ISO 16387, 2003; OECD 202, 2004) para a determinação de parâmetros tradicionais como a sobrevivência e reprodução (6 semanas). Mais recentemente, têm sido realizados testes de “evitamento” (48h), utilizando a capacidade destes organismos evitarem solos contaminados. Embora se conheçam os efeitos de vários tipos de stress nos níveis crónico e agudo, sabe-se muito pouco sobre os efeitos ao nível subcelular e molecular. O principal objectivo deste trabalho experimental consistiu na determinação de marcadores de stress oxidativo, neuro-musculares (cholinesterases) e de expressão génica em E. albidus expostos a diferentes factores abióticos e aos químicos cobre e fenmedifam durante diferentes períodos de exposição e correlacioná-los com efeitos populacionais e comportamentais. A escolha dos químicos cobre e fenmedifam deveu-se ao facto de representarem dois grupos de stressores químicos com diferentes propriedades, presentes frequentemente nos solos, metais e herbicidas, e devido ao conhecimento prévio dos seus efeitos a nível populacional. A escolha dos parâmetros moleculares e sub-celulares utilizados neste estudo deveu-se às seguintes razões: os biomarcadores de stress oxidativo determinados consistem em defesas antioxidantes que destoxificam espécies reactivas de oxigénio e produtos pró-oxidantes, assim como indicadores de dano oxidativo; as colinesterases são biomarcadores enzimáticos relacionados com funções neuronais e musculares e, em particular, as acetilcolinesterases desempenham um papel central no mecanismo de neurotransmissão; a análise de microarrays permite medir directamente as alterações na regulação da transcrição de centenas de genes simultaneamente. Os resultados obtidos mostram que os biomarcadores de stress oxidativo e neuro-musculares determinados são significativamente alterados em E. albidus exposto a diferentes factores abióticos e aos químicos, nos diferentes tempos de exposição. As hibridações dos microarrays revelaram genes diferentemente expressos nas condições testadas. Os resultados obtidos para todos os parâmetros determinados mostram claramente que os solos naturais são mais indicados para testes com E. albidus. Os resultados sugerem que as alterações bioquímicas e moleculares observadas em todas as condições podem estar associadas aos efeitos observados em termos de sobrevivência, reprodução e evitamento. Esta tese demonstra a importância da utilização de diferentes ferramentas em ecotoxicologia terrestre e aponta para o uso de novos parâmetros para uma determinação de stress em ecotoxicologia de solos mais rápida e eficaz.

ABSTRACT: Traditionally, in soil Environmental Risk Assessment (ERA), a set of standardized biological tests are available and commonly performed with Enchytraeus albidus (ISO No 16387, 2003; OECD 202, 2004) for the determination of survival and reproduction endpoints (6 weeks test). More recently this organisms’ ability to avoid contaminated soil has been used to determine avoidance behaviour (48h test). Though stress effects are known at acute and chronic levels for a wide range of stress conditions, very little is known about the sub-cellular and molecular effects in these organisms. The main objective of this work was to assess oxidative stress, neuro-muscular (cholinesterases) and gene expression markers in E. albidus exposed to different soil properties and the chemicals copper and phenmedipham during different exposure periods and to link them with population and behaviour level effects. Copper and phenmedipham were chosen for this study because they are representative of two different groups of chemical stressors with different properties, present commonly in soils, metals and herbicides and due to previous knowledge of effects at population level. The endpoints assessed were chosen for the following reasons: the oxidative stress biomarkers determined consist of antioxidant defences that detoxify reactive oxygen species and prooxidant products, as well as indicators of oxidative stress damage; cholinesterases are biomarker enzymes related with neural and muscular functions and acetylcholinesterase, in particular, plays a central role in the mechanism of neurotransmission; the microarray analysis allows the direct measurement of changes in the transcriptional regulation of many thousands of genes simultaneously. The results showed that the oxidative stress and neuro-muscular biomarkers determined were significantly affected in E. albidus exposed to different soil properties and to the chemicals at the different exposure periods. The microarray hybridizations revealed differentially expressed genes for these stress conditions. The results obtained for all endpoints clearly show that natural soils are more appropriate for ecotoxicological testing with E. albidus. The results suggest that these biochemical and molecular alterations induced by different soil properties and chemicals might be associated with the effects observed on E. albidus survival, reproduction and avoidance behaviour. This thesis shows the importance of using different tools in soil ecotoxicology and points to the use of new endpoints for a quicker stress assessment in soil ecotoxicology.