Detecção e caracterização molecular do poliomavírus em transplantados

Abstract

Os poliomavírus humanos – BKV e JCV – são membros da família Polyomaviridae . As infecções primárias por estes vírus ocorrem geralmente durante a infância e são em regra assintomáticas. Após a infecção primária, os vírus persistem como infecções latentes em vários órgãos, principalmente nos rins. Em condições de imunossupressão, tais como SIDA e transplantação de órgãos, os poliomavírus podem ser reactivados e causar doença. A reactivação do BKV é essencialmente associada a doenças do tracto urinário, como a cistite hemorrágica e outras nefrites. O JCV pode ser reactivado e induzir a leucoencefalopatia multifocal progressiva. Os objectivos deste trabalho foram a detecção dos poliomavírus, em indivíduos dadores de sangue e em doentes submetidos a transplantação de células de progenitoras hematopoiéticas no IPO – Porto, e a elaboração de um protocolo molecular que permitisse a medição do RNAm precoce e tardio. A metodologia utilizada foi a técnica de Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism e a técnica de Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction. Foram analisadas 498 amostras de DNA de indivíduos saudáveis e detectou-se o JCV em 23.9% das amostras analisadas; o BKV foi detectado em 1.8% das amostras, e 74.3% dos indivíduos foram negativos para a presença dos poliomavírus. Foi nos indivíduos do sexo masculino que se detectou o maior número de positivos – 29.5% (p=0.026). Quando comparamos a frequência dos poliomavírus com a idade dos indivíduos, verificamos que há um aumento significativo da frequência nos indivíduos com mais de 56 anos (p=0.006). No grupo dos 34 pacientes detectou-se o BKV em 58.8% dos pacientes; o BKV e o JCV foram detectados em 5.9% dos pacientes, e 35.3% foram negativos para a presença dos poliomavírus. Comparou-se a frequência dos poliomavírus entre os dois grupos estudados e verificou-se que o grupo de doentes tinha um risco acrescido de 5.30 para excretar poliomavírus na urina (OR=5.30; 95% CI 2.4- 11.74; p <0.001). Das células Vero infectadas com o BKV extraiu-se o RNA total e por transcrição reversa obteve-se o DNA complementar. Amplificou-se o RNA mensageiro correspondente ao antigénio T grande e à proteína VP1. Os nossos resultados demonstram que a frequência dos poliomavírus na nossa população é diferente da frequência em algumas populações europeias e semelhante a algumas populações asiáticas. O poliomavírus mais frequente no grupo de doentes é o BKV, o que está de acordo com outros estudos. Através da medição do RNAm que origina a proteína VP1, é possível distinguir-se entre uma infecção latente e uma infecção activa. Futuros estudos são necessários de forma a completar-se o perfil do poliomavírus em indivíduos saudáveis e em doentes, contribuindo para a descoberta de novas terapias e de novos métodos de diagnóstico.

ABSTRACT: The human polyomaviruses – BKV and JCV – are member of the Polyomaviridae family. Primary infections with BKV and JCV occur during childhood and are usually asymptomatic. Following primary infection, the viruses persist as latent infection in many organs, particularly in the kidneys. Under conditions of immunosuppression such as AIDS and organ transplantation both viruses may be reactivated and cause disease. Reactivation of BKV is mainly related to urinary tract diseases such as haemorrhagic cystitis and others nephritis. JCV can be reactivated and induces the disease progressive multifocal leukoencephalopathy. The goals of our study were the detection of polyomaviruses in bone marrow transplant recipients and in blood donors from IPO-Porto; and conceive a molecular protocol to the detection of early and late mRNA. The methodologies used were Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism and Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction. We analysed 498 DNA samples from healthy individuals and we detected JCV in 23.9% of the analysed samples, BKV in 1.8% of the samples and 74.3% of the individuals were negative for polyomaviruses. The males had more positives samples – 29.5% – than the females (p=0.026). When we compared the frequency of polyomaviruses with the age of the individuals we found that it was significantly increased in the individuals with more than 56 years old (p=0.006). In the group of the 34 patients we detected BKV in 58.8% of the patients, BKV and JCV were found in 5.9% and 35.3% were negative for both viruses. We compared the frequency of polyomaviruses between the two groups and we found that the patients have a 5.30 increase in the risk of having polyomaviruses in the urine (OR=5.30; 95% CI 2.4-11.74; p <0.001). From the Vero cells infected by BKV we could extract total RNA and reverse transcribed to complementary DNA. We amplified the mRNA encoding the large T antigen and the VP1 protein. Ours results reveal that the frequency of polyomaviruses in our population is different from other European populations and similar to Asian populations. The more frequent polyomavirus in our patients is BKV, which is comparable to other reports. By measuring the mRNA encoding the VP1 protein it is possible to differentiate between a latent or active infection. Further studies are needed to complete the polyomaviruses profile in healthy individuals and in patients to contribute to the discovery of novel therapies and new diagnostic methods.