Desenvolvimento de uma metodologia de HPLC para a detecção de aductos das catecolaminas com a GSH em amostras biológicas

Abstract

Introdução: Níveis elevados de catecolaminas circulantes podem conduzir a fenómenos de cardiotoxicidade e neurotoxicidade. A cardiotoxicidade pode surgir devido à sobrestimulação de receptores adrenérgicos embora existam evidências crescentes que apontam para um papel importante da oxidação das catecolaminas na ocorrência destes efeitos tóxicos. Também os efeitos neurotóxicos induzidos pela dopamina e pelos seus produtos de oxidação foram já considerados como intervenientes importantes na patofisiologia da doença de Parkinson. Estudos mecanísticos in vitro corroboram estas observações demonstrando que os produtos de oxidação das catecolaminas podem, posteriormente, sofrer conjugação com a GSH em cardiomiócitos e hepatócitos isolados de rato, resultando na formação de espécies de elevada toxicidade. A identificação e quantificação destas espécies reactivas em amostras biológicas é, deste modo, de extrema importância. Objectivo e Métodos: Desenvolver uma metodologia de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para a detecção de aductos das catecolaminas biogénicas, adrenalina, noradrenalina e dopamina, com a GSH em amostras biológicas. Para a síntese dos aductos foram efectuadas misturas reaccionais em soro humano contendo cada uma das catecolaminas em estudo (3,3 nM até 3,75 mM), tirosinase e GSH. Após 12 minutos de reacção, os aductos foram extraídos mediante adsorção na alumina. Foram injectadas alíquotas dos extractos obtidos num sistema de HPLC equipado com um detector de fotodíodos e um detector coulométrico. Foram utilizadas uma coluna Spherisorb S5 ODS2 e uma fase móvel eluída em modo isocrático, a fluxo de 1 mL/min, e constituída por metanol (2 a 10%, dependendo da catecolamina), ácido cítrico (50 mM) e ácido octanossulfónico (0,46 mM) com pH ajustado a 3,0. Os aductos mono- e bi-conjugados das catecolaminas com a GSH foram caracterizados de acordo com os seus espectros no ultravioleta. A posterior análise destes aductos por espectrometria de massa sustentou a sua identidade. Após a optimização das condições para a detecção e extracção destes compostos, foi validado o método para a detecção de aductos da adrenalina (ADR) com a GSH em amostras de soro humano. Resultados/Discussão: Foi desenvolvida uma metodologia de HPLC em modo isocrático e em fase reversa com detecção por fotodíodos e/ou coulométrica, de forma a analisar os aductos de catecolaminas biogénicas com a GSH. Foi igualmente desenvolvido um procedimento de tratamento das amostras de soro humano para análise destes aductos. O método demonstrou possuir uma boa precisão [boa repetibilidade instrumental (CV <3%), boa repetibilidade do procedimento global (CV <5%) e boa precisão intermédia (CV <6%)]. Foi obtida uma resposta linear para concentrações de adrenalina entre 0 e 175 μM. O limite de detecção foi grandemente melhorado pelo processo de extracção (2 pmol e 0,066 pmol de ADR para o primeiro e segundo monoconjugado, respectivamente), enquadrando-se dentro dos níveis esperados de catecolaminas em determinadas condições patofisiológicas. As recuperações da extracção foram diferentes para os dois monoconjugados da ADR com a GSH (entre 51 e 93%, dependendo do aducto e da concentração de ADR testada). Em conclusão, o desenvolvimento desta metodologia permite a análise directa de aductos da adrenalina com a GSH em soro humano, demonstrando ser uma importante ferramenta analítica para o estudo do processo de oxidação das catecolaminas e da toxicidade associada a estes compostos.

ABSTRACT: Introduction: Sustained high levels of circulating catecholamines may lead to cardiotoxicity and neurotoxicity. Cardiotoxicity can occur via adrenoceptor overstimulation although increasing evidence also points toward an important role of the catecholamines oxidation in the induction of these toxic effects. Furthermore, neurotoxic effects induced by dopamine and its oxidation products are considered to be important factors contributing to the pathogenesis of Parkinson’s disease. Mechanistic in vitro studies corroborate these findings since they have shown that the catecholamines oxidation products can further conjugate with GSH in isolated rat cardiomyocytes and hepatocytes leading to the formation of highly toxic species. The identification and quantification of these reactive species in biological samples is, thus, of utmost importance. Aim and Methods: To develop an high performance liquid chromatography (HPLC) methodology for detection of GSH adducts of the biogenic catecholamines adrenaline, noradrenaline, and dopamine in biological samples. For the synthesis of the adducts reaction mixtures were made in human serum containing each catecholamine (3.3 nM up to 3.75 mM), tyrosinase and GSH. After 12 min of reaction, the adducts were extracted after adsorption to alumina. Aliquots of these extracts were injected into an HPLC system equipped with a photodiode array detector and a coulochem detector. A Spherisorb S5 ODS2 column and an isocratic mobile phase consisting of methanol (2 up to 10%, depending on the catecholamine), citric acid (50 mM) and octanesulfonic acid (0.46 mM) adjusted to pH 3.0 at a 1 mL/min flow rate were used. The mono- and bi-conjugates of catecholamines with GSH were characterized by their UV spectra. Further analysis by mass spectrometry of these adducts sustained their identity. After the optimization of all the conditions for the detection and extraction of these compounds, the method was validated for the detection of adrenaline (ADR) GSH adducts in human serum. Results and Discussion: An isocratic reverse-phase HPLC method with photodiode array and/or coulochem detection was developed in order to analyse biogenic catecholamines-GSH adducts. A sample treatment procedure for analysis of these adducts in biological samples was also developed and applied to human serum. The method showed good precision [good instrumental repeatability (<3% CV), good overall procedure repeatability (<5% CV), and good intermediate precision (< 6% CV)]. A linear response was obtained for adrenaline concentrations of 0 to 175 μM. The limit of detection was greatly improved by the extraction process (2 pmol and 0.066 pmol for the 1st and 2nd mono GSH conjugates, respectively) falling into the expected catecholamine levels occurring in certain pathophysiological conditions. The extraction recoveries were different for both adrenaline-GSH monoconjugates (between 51 and 93%, depending on the adduct and on the tested adrenaline concentration). In conclusion, the development of this method allows the direct analysis of GSH adducts of adrenaline in human serum, providing a valuable tool for the study of the catecholamines oxidation process and the toxicity associated with these compounds.