Carbapenemases of Serratia fonticola UTAD54

Abstract

As carbapenemases, serínicas e metalo-β-lactamases (MBLs), formam um grupo cada vez mais importante de β-lactamases capazes de tornar as bactérias resistentes a antibióticos β-lactâmicos, incluindo carbapenemos utilizados como antibióticos de último recurso no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes. De modo a compreender melhor a relação estrutura-função deste grupo de enzimas, prosseguimos com a caracterização bioquímica e estrutural das carbapenemases SFC-1 e Sfh-I específicas de Serratia fonticola UTAD54, uma estirpe ambiental isolada previamente de águas de consumo não tratadas no Nordeste de Portugal. Ambas as β-lactamases foram sobre-expressas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia líquida. A SFC-1 recombinante, uma carbapenemase serínica, hidrolisa eficientemente antibióticos β-lactâmicos de todas as classes e exibe, comparativamente a enzimas relacionadas (ex. KPC), uma maior eficiência contra a ceftazidima e uma menor susceptibilidade aos inibidores convencionais das β-lactamases. As estruturas do cristal da SFC-1 nativa e de complexos de mutantes, obtidos por mutagénese dirigida, com o meropenemo não hidrolisado e na forma de acetilenzima foram determinados por substituição molecular utilizando cristalografia de raios-X. A estrutura da SFC-1 contém todas as características conservadas do centro activo das carbapenemases de classe A. Nas estruturas dos mutantes o meropenemo aparece orientado no centro activo por Thr236 e Thr238, posicionando-o próximo da Ser130 para a transferência do protão. Nas enzimas de classe A inibidas por carbapenemos, a interacção com a Arg244 impõe uma orientação diferente do meropenemo ligado, prejudicando a transferência do protão. Estas constituem as primeiras estruturas de uma carbapenemase de classe A com um carbapenemo no centro activo e revelam que estas enzimas alteram a orientação do meropenemo ligado para promover a catálise, sem alteração significativa da estrutura geral. A Sfh-I, tal como as outras MBLs da subclasse B2, apresenta um perfil de substratos reduzido, que inclui maioritariamente os carbapenemos. A Sfh-I hidrolisa imipenemo e meropenemo com um kcat de 51 e 109 s-1 e um KM de 79 e 215 μM, respectivamente. A Sfh-I liga um equivalente de zinco, como demonstrado por espectrometria de massa. Contrariamente a enzimas da subclasse B2 previamente caracterizadas, a Sfh-I hidrolisa a cefepima, mostrando que a Sfh-I é uma MBL da subclasse B2 com propriedades únicas. Por espectroscopia de fluorescência mostrou-se que a Sfh-I é capaz de ligar até 3 equivalentes de zinco (Kd2 = 95 μM; Kd3 = 2.3 mM). A estrutura do cristal da Sfh-I, determinada por substituição molecular utilizando a CphA como modelo, é a primeira para uma MBL da subclasse B2 não ligada. Esta estrutura revela a disposição das moléculas de água no centro activo corroborando um mecanismo catalítico para as MBLs da subclasse B2 no qual a His118, em vez do Asp120 proposto anteriormente, activa a molécula de água nucleofílica.

Carbapenemases, both serine and metallo-β-lactamases (MBLs) constitute an increasingly important group of β-lactamases that render bacteria resistant to β-lactam-containing antibiotics, including carbapenems used as last resort antibiotics in treatment of multidrug resistant bacteria. In order to better understand the structure-function relationship among this group of enzymes we pursued the biochemical and structural characterization of SFC-1 and Sfh-I both carbapenemases specific to Serratia fonticola UTAD54, an environmental strain previously isolated from untreated drinking waters in Northeast Portugal. Both β-lactamases were over-expressed in Escherichia coli and purified by liquid chromatography. Recombinant SFC-1, a serine carbapenemase, efficiently hydrolyses β-lactams of all classes and exhibits, as compared to related enzymes (e.g. KPC), an increased activity towards ceftazidime but a decreased sensitivity to conventional β-lactamase inhibitors. Crystal structures of wild-type SFC-1 and of complexes of site-directed mutants with the meropenem in unhydrolysed and acylenzyme intermediate forms were solved by molecular replacement using X-ray crystallography. Wild-type SFC-1 has all the conserved features of the class A carbapenemases active site. In the mutants structures meropenem is shown to be oriented in the active site by Thr236 and Thr238, placing it close to Ser130 for proton transfer. In the carbapenem-inhibited class A enzymes interaction with Arg244 imposes a different orientation on bound meropenem, impairing proton transfer. These first structures of a class A carbapenemase with bound carbapenem reveal that these enzymes change the orientation of bound meropenem to promote catalysis, without gross distortion of overall structure. Sfh-I, like other subclass B2 MBLs, has a narrow substrate profile which mostly include carbapenems. Sfh-I hydrolyses imipenem and meropenem with a kcat of 51 and 109 s-1 and KM of 79 and 215 μM, respectively. Purified Sfh-I binds one equivalent of zinc, as shown by mass spectrometry. Unlike previously characterised subclass B2 enzymes, Sfh-I hydrolyzes cefepime showing that Sfh-I is a subclass B2 MBL with unique properties. Fluorescence spectroscopy shows that Sfh-I is able to bind up to 3 zinc equivalents (Kd2 = 95 μM; Kd3 = 2.3 mM). The Sfh-I crystal structure, solved by molecular replacement using CphA as search model, is the first of an unliganded B2 MBL. This structure reveals the disposition of water molecules in the active site supporting a catalytic mechanism for subclass B2 MBLs in which His118, rather than the previously proposed Asp120, activates the nucleophilic water molecule.