Contribuição das células percursoras miogénicas para a plasticidade muscular esquelética no modelo animal

Abstract

O presente trabalho teve como objectivo geral verificar qual a contribuição das CS e de outras células stem musculares esqueléticas na plasticidade muscular. Para o alcançar, foram delineados três objectivos específicos: i) desenvolver uma metodologia fiável que permitisse avaliar células em proliferação na globalidade do tecido ii) estudar a evolução do processo de regeneração muscular com a utilização de marcadores bioquímicos e morfológicos de lesão/regeneração iii) verificar a existência de alterações na expressão de proteínas contrácteis e metabólicas no tecido muscular, após inibição de células em proliferação. De forma a atingir o primeiro objectivo adaptou-se o método de South Western ao tecido muscular esquelético utilizando diferentes doses de BrdU e quantidades distintas de DNA. Esta metodologia mostrou-se mais sensível para a dose de 50 mg de BrdU/Kg e para 1 μg de DNA. Adicionalmente, os valores de densidade óptica obtidos evidenciaram uma elevada correlação com o número total de núcleos marcados por imunohistoquímica. Para alcançar o segundo objectivo, foi induzida lesão por esmagamento do gastrocnemius e estudou-se o processo de regeneração durante 20 dias, recorrendo a parâmetros bioquímicos (calpaínas, N-acetilglucosaminidase, mieloperoxidase, caspase-3, Bax, Bcl-2 e proliferação celular) e morfológicos (microscopia óptica e electrónica). Os resultados evidenciaram uma intensa proteólise nas fases iniciais, uma resposta inflamatória significativa aos 2º e 4º dias pós lesão e uma resposta apoptótica acentuada nas fases iniciais e finais do processo regenerativo. Relativamente à proliferação celular, esta foi mais evidente aos 4º e 6º dias pós lesão. Os dados morfológicos suportaram de forma coesa as alterações bioquímicas observadas. Para dar resposta ao terceiro objectivo, avaliou-se a expressão de isoformas de miosinas de cadeia pesada e leve após lesão por esmagamento do gastrocnemius, em animais tratados e não tratados com colchicina. A colchicina inibiu a proliferação celular, não tendo sido, por isso, detectadas alterações fenótipicas significativas ao longo do processo regenerativo em estudo. Em suma, os dados obtidos neste trabalho sugerem que as CS e outras células stem musculares têm um papel fundamental nas alterações fenótipicas observadas no músculo esquelético de ratinho após a indução de lesão por esmagamento.

The general purpose of this work consists of analyzing the contribution of SC and other muscular stem cells in muscular plasticity. To reach this objective, three specific purposes were drawn: i) to develop a reliable methodology that allows to assay proliferative cells in whole muscle tissue ii) to study the evolution of the muscle regeneration process using biochemical and morphological parameters iii) to analyze changes in the expression of skeletal muscle contractile and metabolic proteins after inhibition of cell proliferation. To reach the first purpose, the South Western assay was adapted to skeletal muscle tissue using different doses of BrdU and distinct quantities of DNA. This methodology evidenced higher sensitivity to 50mg BrdU/Kg and to 1μg of DNA. Additionally, the optical density values obtained by this methodology showed a high correlation with the total number of immunohistochemically labelled nucleus. To attain the second purpose, mice gastrocnemius muscle was injured by crush and the regeneration process was studied throughout 20 days using biochemical (calpains, N-acetyl-glucosaminidase, myeloperoxidase, caspase-3, Bax, Bcl-2 and cellular proliferation) and morphological (electron and light microscopy) parameters. The results of this study showed an intense proteolyses in the earlier phases, a significant inflammatory response on the 2nd and 4th days after damage, and a pronounced apoptotic response in the beginning and at the end of the regenerative process. The levels of cellular proliferation were higher in the 4th and 6th days after damage. The morphological findings were consistent with the observed biochemical alterations. To achieve the third purpose, the expression of heavy and light myosin isoforms was studied after damage of gastrocnemius from animals treated and non-treated with colchicine. Colchicine administration inhibited celullar proliferation and thus, no significant phenotypic alterations were observed, namely myosin isoforms, during the considered regeneration period. In summary, the data obtained in this study suggest the involvement of SC and other muscular stem cells on mice skeletal muscle phenotypic changes observed after trauma.