As proteínas HBP/SOUL : sobre-expressão, purificação e estudo de mutantes

Abstract

O objectivo deste trabalho consistiu na optimização da purificação das proteínas HBP/SOUL que ligam ao grupo Hemo, bem como o estudo da interacção destas proteínas, e seus variantes, com grupos tetrapirrólicos. Na optimização do processo de purificação, a lise celular foi uma das etapas estudadas, comparando-se a eficácia da lise celular através do uso de sonicação e alta pressão. Esta avaliação foi feita por comparação dos géis SDS-PAGE obtidos a partir dos extractos celulares. Para além da lise celular, foi também estudada a purificação por cromatografia de afinidade, com o recurso de resinas Ni-NTA, com o intuito de encontrar o melhor gradiente de imizadole para obter uma fracção de HBP/SOUL o mais pura possível. A proteína mHBP foi posteriormente sujeita a estudos de extinção de fluorescência, quando exposta a compostos tetrapirrólicos nomeadamente a Hemina e a Protoporfirina IX. Estes estudos foram alargados a determinados mutantes da mHBP, nomeadamente a M59S, M63S, R181A, uma vez estes resíduos se situarem na região de ligação da mHBP aos compostos tetrapirrólicos. As constantes de dissociação determinadas indicam que a alteração da polaridade na região hidrofóbica de interacção da mHBP com o grupo Hemo, não tem efeitos significativos na afinidade da interacção destas duas moléculas. Através da mutagénese dirigida foi possível a construção de mutantes de HBP nomeadamente R56A, R56E, K56A/K64A possibilitando assim no futuro, a continuação dos estudos de extinção de fluorescência de forma a compreender a função destas proteínas em relação ao grupo Hemo.

The aim of this work was the optimization of purification of proteins HBP/SOUL that bind to Heme group, as well as the study of interaction of these proteins and their variants with tetrapyrrole compounds. In the optimization of the purification process, cell lysis was studied by, comparing sonication with high pressure method. This evaluation was made by comparing SDS-PAGE gels of a cell extracts. In addition to cell lysis, purification by affinity chromatography, using Ni-NTA resins, was studied to find the best imidazole gradient to obtain a HBP/SOUL fraction as pure as possible. The p22HBP protein was also studied by fluorescence quenching , when exposed to tetrapyrrole compounds such as Hemin and Protoporphyrin IX. These studies were extended to mHBP mutants, M59S, M63S, R181A, once these residues are located in the protein binding pocket. The dissociation constants show that the modification of polarity of this binding pocket, does not affect significantly the affinity of these compounds. By site directed mutagenesis, it was also possible to construct the mHBP mutants, R56A, R56E, K56A/K64A allowing, in the future, the continuation of these studies of Fluorescense Quenching, to understand the main role of this proteins and how they affect the interaction with Hemo.