Estudo protocolar por RMN na análise do metaboloma das saccharomyces cerevisiae

Abstract

Este trabalho focou-se na optimização de um processo que possibilitasse a obtenção de perfis globais metabólicos, por NMR, e na identificação do maior número de metabolitos intracelulares das leveduras Saccharomyces cerevisiae com erros de tradução. O método experimental a utilizar na extracção de metabólicos intracelulares em células eucarióticas para análise por NMR, deve preencher determinados requisitos: rendimento elevado, reprodutibilidade, simplicidade e rapidez. Existem vários factores que influenciam este estudo. Com o intuito de encontrar um método eficaz, analisaram-se todas as variáveis a controlar, estudando-se: os meios de crescimento; as curvas de crescimento, de forma a saber onde recolher as células ao longo do seu crescimento; e alguns procedimentos de extracção dos metabolitos. Obtidos os extractos metabólicos (<5 kDa) através de diferentes métodos, adquiriram-se espectros 1D e, para amostras seleccionadas, 2D 1H-13C-HSQC. Usando a análise por PCA identificaram-se algumas variáveis experimentais, posteriormente controladas de forma a diminuir a variabilidade entre amostras e encontrar um processo de obtenção de extractos metabólicos eficiente. O método optimizado apresenta semelhanças com o método utilizado por Lewis et al, no qual são usadas duas fases de liofilização. Ao fim da primeira liofilização, adicionam-se esferas de vidro (5 mm) aos extractos liofilizados, seguidamente vortexados a seco. Posteriormente é filtrado (< 5 kDa) e liofilizado novamente. Este trabalho também passou pela identificação de um maior número de metabolitos característicos das Saccharomyces cerevisiae. Em trabalhos anteriores, o número conhecido é de 40 metabolitos e, no nosso caso, são apresentados cerca de 60 compostos claramente identificados recorrendo à técnica de NMR.

This work focused on the optimization of an experimental method for obtaining global metabolic profiles by NMR and on the identification of the maximum number of intracellular metabolites present in yeast, particularly Saccharomyces cerevisiae with high levels of mistranslation. Optimization of experimental methods used for the extraction of intracellular metabolites in eukaryotic cells using NMR, must meet fundamental requirements like high yield, reproducibility, simplicity and it should also be straightforward. Optimization of an experimental process is not always easy to optimize, since many factors can affect it. In order to achieve our objectives, the experimental variables were minimized by studying: the growth media; the growth curves, in order to recognize when to collect the cells; and the metabolite extraction procedures. After obtaining the metabolic extracts (<5 kDa) using different methods, 1D spectra were acquired and, for selected samples, 2D 1H-13CHSQC spectra were also acquired. Using unsupervised PCA analysis, important variables were identified and, subsequently, controlled in order to reduce the variability between samples and optimise an efficient process to obtain metabolic extracts. The final optimised experimental method, similar to that of Lewis et al., consists in two stages of lyophilisation. After the first lyophilisation, glass beads (5 mm) were added to the lyophilised extracts and then submitted to vigorous dried vortex. After dissolved in a buffer, the extracts were filtered (<5 kDa) and again lyophilized. As previously said, this work also consisted in the identification of a maximum number of characteristic metabolites present in yeast. The maximum number of identified metabolites was ca 40, as showed in previous studies. However, in our work, we were able to clearly identify ca. 60 compounds using NMR.